真核生物細胞膜是一種具有半透性的生物膜,構(gòu)成了細胞內(nèi)、外物質(zhì)選擇性交換的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),因而對于維持細胞的生存和正常功能的發(fā)揮具有關(guān)鍵性作用。然而,由于存在著這一天然屏障,一些被證明具有良好治療效果和疾病診斷價值的生物大分子,例如非脂溶性的蛋白、抗體、多肽、核酸、極性藥物分子、探針以及顯像劑等卻很難到達細胞內(nèi)發(fā)揮應(yīng)有的作用。近十幾年來,細胞穿透肽（cell-penetrating peptides,CPPs）陸續(xù)發(fā)現(xiàn),并得到深入研究,這一領(lǐng)域開啟了細胞內(nèi)輸送載體研究的新紀元,CPPs亦被證明是目前實現(xiàn)細胞內(nèi)運輸最為有效的手段之一。大量的研究證實,CPPs可以有效地將親水性蛋白質(zhì)、多肽、核酸、極性化學(xué)分子甚至量子點等,導(dǎo)入多種細胞中,不僅能夠保證活性分子正常發(fā)揮作用,并且在一定濃度范圍內(nèi)不會造成細胞損傷。尤其是某些CPPs能夠攜帶貨物分子穿過血腦屏障、血睪屏障、胎盤屏障等人體重要的屏障系統(tǒng)發(fā)揮作用。因而,CPPs作為有效的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運工具,在細胞生物學(xué)、細胞免疫學(xué)、藥物開發(fā)、基因生物治療以及腫瘤靶向治療等研究領(lǐng)域,均具有廣闊而重要的應(yīng)用前景。CPPs的發(fā)現(xiàn)為細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了極佳的研究... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：139 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．細胞內(nèi)吞的不同形式［Ｕ］??

圖１－１?１０倍系列稀釋噬菌體的滴度測定??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｉｔｅｒｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｉｎ?１０－ｆｏｌｄ?ｓｅｒｉａｌ?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ??Ａ，?３?ｐｆｕ?ｉｎ?１０１１?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ；?Ｂ，?２２?ｐｆｕ?ｉｎ?１０１０?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ；?Ｃ，?１７６?ｐｆｕ?ｉｎ?１０９?ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ?ｐｌａｔｅ??１．３．２噬菌體肽庫的篩選及富集效果分析??篩選過程中選擇生長狀態(tài)良好的細胞，同時嚴格控制每輪篩選時加入噬菌??體的數(shù)量，以保證穩(wěn)定的篩選結(jié)果。通過統(tǒng)計每輪淘選前加入的嗟菌體量與洗??脫后的噬菌體量，計算回收率。比較４輪淘選后噬菌體回收率（如表１－１），可以??發(fā)現(xiàn)從第一輪至第四輪，能夠內(nèi)化Ｈｅｌａ細胞的噻菌體回收量逐輪遞增，淘選所得??的噬菌體回收率逐步提高，內(nèi)化入Ｈｅｌａ細胞中的噬菌體數(shù)目在第二、三和四輪篩??選后分別是上一輪次噬菌體數(shù)目的４．６３、１０．３５和８．４４倍。上述結(jié)果顯示，通過４??輪的全細胞篩選，內(nèi)化Ｈｅｌａ細胞的噬菌體得到了明顯富集。??表１－１噬菌體隨機７肽庫的淘選和富集結(jié)果??Ｔａｂ．?１－１?Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｄｉｓｐｌａｙ?７－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｌｉｂｒａｒｉｅｓ??

第一章細胞穿透肽的禮菌體展示技術(shù)篩選??菌體空載體ＤＮＡ的ＰＣＲ產(chǎn)物大小為２５８ｂｐ，因此通過電泳檢測可以達到區(qū)分并剔??除空噬菌體的目的。如圖１－２中，泳道２、６、７為噬菌體空載體的ＰＣＲ產(chǎn)物，而１、??３、４、５、８、９和１０的模板為插入了片段的噬菌體。選取有插入片段的噬菌體克??隆，并對其ＰＣＲ產(chǎn)物進行直接測序。??Ｍ?１?２?３?４?５?ｄ?７?８?９?１０??ｂｐ??２０００??１５００??１０ｕｕ?ｋ??５００??４００丨??３００丨??２００?Ｉ??１００?Ｉ??圖１－２噬菌體ＤＮＡＰＣＲ產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ＤＮＡ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??Ｌａｎｅ?Ｍ，?ＤＮＡ?ｌａｄｄｅｒ；?Ｌａｎｅ?２，６，７，?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｅｍｐｔｙ?ｐｈａｇｅ?ｖｅｃｔｏｒ；?Ｌａｎｅ?１，３，４，５，８，９，１０，??ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｐｈａｇｅ?ｖｅｃｔｏｒ?ｗｉｔｈ?ｉｎｓｅｒｔ．??１．４討論??噬菌體展示技術(shù)，是一種用于篩選功能性多肽的蛋白質(zhì)組學(xué)常用生物技術(shù)［２３，??２４］。其原理是將編碼多肽的ＤＮＡ片段與噬菌體衣殼蛋白編碼基因進行重組，并??以融合蛋白的形式表達在噬菌體的表面�；谏锓肿优c靶分子的親和力，通??過吸附－洗脫－擴增的重復(fù)過程，將含有能與靶分子特異結(jié)合的噬菌體從表達各種??外源蛋白的噬菌體庫中篩選出來，然后進行富集、擴增及基因序列測定，從而??獲得外源蛋白的氨基酸組成。在本實驗中


本文編號：3531388