本文關(guān)鍵詞：腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構(gòu)建腎癌組織特異性復制缺陷型5型腺病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,該病毒攜帶腎癌組織特異性啟動子碳酸酐酶IX和報告基因人源型綠色熒光蛋白(hrGFP-1),為外周血中循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的檢測等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法:利用BglII、PmeI雙酶切穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1、pShuttle-CAIX-E1A分別得到目的片段hrGFP-1及基因載體,T4 DNA連接酶過夜連接,構(gòu)建含有報告基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-IERS-hrGFP-1。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α后經(jīng)涂板、PCR、酶切鑒定,挑選陽性菌落大量擴增,獲取重組質(zhì)粒。提取的陽性質(zhì)粒經(jīng)PmeI線性化,轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒AdEasy-1的感受態(tài)細胞BJ5183,利用同源重組技術(shù),構(gòu)建病毒質(zhì)粒pAd5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1。經(jīng)PCR、酶切共同鑒定,陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α中大量擴增、提取并凍存菌液。陽性質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后,線性化質(zhì)粒利用Lipofectamin 2000TM介導作用,轉(zhuǎn)染HEK293細胞,獲得重組腺病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,經(jīng)4輪擴增后收集、純化病毒,檢測其滴度。結(jié)果:成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒、重組腺病毒質(zhì)粒并且完成其包裝過程。PCR和酶切的電泳結(jié)果顯示,hrGFP-1基因成功嵌入重組穿梭質(zhì)粒及腺病毒質(zhì)粒,酶切分析與Vector NTI Advance 11軟件結(jié)果一致,證實重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1及腺病毒質(zhì)粒pAd5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1構(gòu)建正確;在病毒包裝和后續(xù)四輪擴增過程中,重組腺病毒在HEK293細胞內(nèi)熒光表達正常,細胞病變明顯,證實病毒包裝成功,經(jīng)檢測其滴度為1.87×1010pfu/ml。結(jié)論:攜帶報告基因的腎癌組織特異性復制缺陷型5型腺病毒構(gòu)建成功,重組后的病毒Ad5-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1,為外周血中腎癌循環(huán)腫瘤細胞的檢測奠定基礎(chǔ),為后續(xù)腎癌單細胞基因分析、判斷患者腎癌分期、預后及指導個體化治療提供新的契機。
【關(guān)鍵詞】：腎癌 循環(huán)腫瘤細胞 碳酸酐酶IX啟動子 人源化綠色熒光蛋白 重組腺病毒 HEK293細胞
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮略詞6-9
• 前言9-13
• 1 材料和方法13-21
• 1.1 實驗材料13-15
• 1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細胞13
• 1.1.2 實驗試劑13
• 1.1.3 實驗試劑盒13
• 1.1.4 設(shè)備及儀器13-14
• 1.1.5 主要溶液及配制14-15
• 1.2 實驗方法15-21
• 1.2.1 重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CAIX-E1A-IRES-hrGFP-1 的構(gòu)建及鑒定15-17
• 1.2.2 重組病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定17-19
• 1.2.3 重組腺病毒包裝及擴增19-21
• 2 結(jié)果21-24
• 2.1 原有質(zhì)粒鑒定21
• 2.2 重組穿梭質(zhì)粒鑒定21-23
• 2.3 重組腺病毒質(zhì)粒鑒定23
• 2.4 重組腺病毒的包裝、擴增及病毒滴度測定23-24
• 3 討論24-29
• 4 結(jié)論29-30
• 參考文獻30-35
• 綜述35-42
• 參考文獻39-42
• 在學期間科研成果42-43
• 致謝43

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 張梅林,周雪峰,曹登峰,繆時英,吳燕婉,邢志軍,宗書東,王琳芳;一種與不育有關(guān)的人精子蛋白質(zhì)的組織特異性及表達[J];中國醫(yī)學科學院學報;1999年03期

2 山松,朱云艷,翟鵬,毛澤斌,童坦君;人A33基因5′調(diào)控區(qū)的組織特異性表達元件[J];中國生物化學與分子生物學報;2002年04期

3 曹文媛;葉青;李曉峰;王洪江;朱舜亞;秦鄂德;江振友;秦成峰;;攜帶腦組織特異性microRNA靶序列的重組日本腦炎病毒的構(gòu)建與鑒定[J];解放軍醫(yī)學雜志;2014年06期

4 龐衛(wèi)軍;衛(wèi)寧;王禹;熊燕;童強;楊公社;;脂肪組織特異性PU.1敲除小鼠的鑒定及其活體脂肪和肌肉含量分析[J];畜牧獸醫(yī)學報;2014年02期

5 雷俊川;宮衛(wèi)東;趙亞;姜河;劉忠湘;易軍;;四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)對乙型肝炎病毒核心啟動子活性及組織特異性的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2009年12期

6 章靜波;;離體雞胚胚盤外胚層對腫瘤組織的反應[J];解剖學報;1981年02期

7 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 徐宇瑾;安林;樊景禹;;大鼠心肌、肝臟和表皮縫隙連接的組織特異性[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

2 代紅久;蔣容靜;費儉;;利用UAS/Gal4雙系統(tǒng)在家蠶中開啟條件性,組織特異性RNAi技術(shù)[A];第二屆中國動物學會比較內(nèi)分泌學分會和發(fā)育生物學分會聯(lián)合學術(shù)研討會論文集[C];2005年

3 王修啟;譚會澤;蘇海林;代發(fā)文;馮定遠;;雞胃腸道SS mRNA表達的組織特異性[A];全國動物生理生化第九次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2006年

4 王修啟;譚會澤;蘇海林;代發(fā)文;馮定遠;;雞胃腸道生長抑素mRNA表達的組織特異性[A];動物營養(yǎng)與飼料研究——第五屆全國飼料營養(yǎng)學術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 張艷芳;汪以真;單體中;;豬FoxO1基因表達的組織特異性和品種特異性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物營養(yǎng)學分會第十次學術(shù)研討會論文集[C];2008年

6 王修啟;譚會澤;束剛;蘇海林;陳黎龍;江青艷;馮定遠;;雞腸道SGLT1和GLUT2 mRNA表達的組織特異性研究[A];動物營養(yǎng)與飼料研究——第五屆全國飼料營養(yǎng)學術(shù)研討會論文集[C];2006年

7 王媛;時亮;張軍;婁曉敏;李娜;舒紹坤;陳希曙;趙康;邵建敏;徐寧志;劉斯奇;;小鼠不同組織中線粒體蛋白質(zhì)組的差異分析[A];中國蛋白質(zhì)組學第三屆學術(shù)大會論文摘要[C];2005年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蔣征;豬糖皮質(zhì)激素受體基因表達的組織特異性：啟動子活性和LPS處理下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 張楊;腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定[D];蘭州大學;2016年

2 趙菲菲;人類基因啟動子序列組織特異性模式發(fā)現(xiàn)[D];天津大學;2012年

3 胡翔天;基因表達組織特異性及服務(wù)平臺研究[D];天津大學;2012年

4 許華琳;人類基因啟動子序列模式組織特異性顯著性檢驗及功能分析[D];天津大學;2012年

5 沈良才;家豬脂肪組織特異性啟動子元件的克隆[D];河北科技師范學院;2013年

6 唐麗;組織特異性細胞外基質(zhì)對體外培養(yǎng)hPDLSCs干細胞特性的維持及體內(nèi)分化的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2014年

7 蔣德志;鈉離子碳酸氫根共轉(zhuǎn)運體基因Slc4a10表達產(chǎn)物的克隆、鑒定及組織特異性的研究[D];華中科技大學;2013年

  本文關(guān)鍵詞：腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：344078