研究背景:P62（也稱sequestosome-1或SQSTM1）可通過多種途徑參與自噬的調(diào)控。它可與自噬體膜蛋白LC3-II相結(jié)合,促使泛素化蛋白聚集體被自噬體吞噬,與組蛋白去乙�；窰DAC6相作用抑制其去乙酰化酶活性,從而維持乙�；�-微管蛋白的水平及微管蛋白的穩(wěn)定性,調(diào)控自噬體轉(zhuǎn)運過程。此前研究對人前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）及良性前列腺增生患者（Benign Prostatic Hyperplasia,BPH）組織進行免疫組化實驗,發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的P62水平顯著高于前列腺增生患者,且高水平的P62與腫瘤的分級及轉(zhuǎn)移密切相關。在此基礎上,本研究擬進一步探明P62對前列腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及自噬的影響,并探討其中可能的作用機制。研究方法:本研究通過慢病毒載體技術構(gòu)建了P62過表達DU145細胞株,并利用CRISPR/Cas9技術構(gòu)建P62敲除DU145細胞株,進行CCK8及結(jié)晶紫染色等細胞增殖實驗、細胞遷移實驗、細胞侵襲實驗;以及Western blot免疫印跡分析和共聚焦熒光顯微鏡的應用來闡明P62水平的改變對PCa細胞增殖、遷移、侵襲、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化態(tài)... 

【文章來源】：廣州醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

（A和C圖）分別代表P62過表達對照組（C1）和P62過表達組（OE）DU145細胞

圖 2. P62 抑制細胞自噬。（A 和 B 圖）分別代表在巴普羅霉素 A1 作用下（BAF）及無巴普羅霉素 A1 作用下（Ctrl）細胞自噬標志物蛋白 LC3-II 的表達水平的蛋白免疫印跡分析條帶及量化統(tǒng)計結(jié)果；（C 和 D 圖）分別代表各組 DU145 細胞中 LRPPRC 蛋白免疫印跡分析條帶及量化統(tǒng)計結(jié)果；**, P≤0.01; ***, P≤0.001。2．P62 促進 PCa 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化態(tài)的形成我們在研究過程中發(fā)現(xiàn)，P62 的表達變化顯著影響 DU145 細胞形態(tài)的改變：存在由上皮樣形態(tài)切換到間充質(zhì)樣外觀的變化。相應地，DU145 細胞的形狀由圓形細胞變得不規(guī)則多邊形（圖 3A）。這提示過表達 P62 參與調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形態(tài)轉(zhuǎn)變。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌癥轉(zhuǎn)移的重要事件[29]。在癌的轉(zhuǎn)移過程中，極化上皮腫瘤細胞具有遷移性和侵襲性，以便從原發(fā)腫瘤部位傳播[30-33]。因此，我們對這兩類細胞上的特異標記蛋白進行檢測�？梢园l(fā)現(xiàn)，對照組 DU145

圖 3. P62 促進細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。（A 圖）表示各實驗組及對照組細胞在 10 倍及 40 倍鏡下的形態(tài)對比圖像；（B-J 圖）代表蛋白免疫印跡分析條帶（B，E 和 H）及量化統(tǒng)計結(jié)果（C,D, F, G, I,和 J）；上皮細胞特征標志蛋白 E-鈣粘蛋白表達水平（B-D）；間質(zhì)細胞特征標志蛋白波形蛋白 Valentine 表達水平（E-G）及纖維蛋白 Fibronectin 表達水平（H-J）；**, P≤0.01;***, P≤0.001。3．P62 增強組蛋白去乙�；� HDAC6 的活性并抑制去乙�；�-α-微管蛋白的形成研究表明，組蛋白去乙�；� 6 的水平（HDAC6）是上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)型過程中對細胞遷移和侵襲的必要因素[31, 34]。抑制 HDAC6 表達可以增加 α-微管蛋白的乙�；�，從而降低微管運動，減少局部粘附的轉(zhuǎn)化率和降低細胞遷移[35]；此外，乙�；⒐苁亲允审w與溶酶體融合轉(zhuǎn)運過程必需的[36]，激活


本文編號：3388549