發(fā)布時(shí)間：2019-11-28 22:37

【摘要】：目的：研究miR-124通過調(diào)控flotiliin-2對精子發(fā)生過程中頂體形成的作用,并進(jìn)一步探討miR-124在頂體形成過程中的表達(dá)機(jī)制。方法：首先,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件驗(yàn)證miR-124與flotillin-2的mRNA 3'-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)；然后,采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)探討miR-124對flotillin-2的靶向調(diào)控關(guān)系；接著,采用睪丸網(wǎng)微注射技術(shù),將miR-124活性片段直接注射入三周齡雄性小鼠的生精小管,48小時(shí)后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫技術(shù)驗(yàn)證miR-124對flotillin-2的影響；最后,在睪丸網(wǎng)微注射三周后,運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察小鼠精子的形態(tài)。結(jié)果：生物信息學(xué)證實(shí)miR-124與flotillin-2的mRNA 3'-UTR存在直接互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)miR-124表達(dá)上調(diào),flotillin-2的表達(dá)水平下降,miR-124對flotillin-2的表達(dá)起著負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的精子畸形率明顯增加(28.5%vs.19.9%,P=4.68*10-5),特別是頭部畸形(20.7%vs.13.7%,P=0.025),這些差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且大部分頭部畸形精子的頂體都有異常。透射電鏡顯示頭部畸形小鼠精子的超微結(jié)構(gòu)為：1)頂體缺失：2)頂體形態(tài)異常--頂體中存在分散的、沒有融合的小顆粒或小囊泡；存在較大的頂體囊泡；存在殘留的或退化的高爾基復(fù)合體。結(jié)論：miR-124可以通過調(diào)控flotillin-2的表達(dá)影響精子頂體的形成,為探索精子發(fā)生過程中頂體形成的的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)為男性不育的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和干預(yù)靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖１：頂體形成模式圖。逡逑來自邋Ｒａｍａｌｈｏ－ＳａｉＵｏｓ邋Ｊ邋，邋ｅｔ邋ａｌ逡逑ｎｔｒｏｌ邋ｏｆ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｓｐｅｒｍｉｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ａｎｄ邋化ｅ邋ａｃｒｏｓｏｍｅ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ》。逡逑研究中，我們發(fā)現(xiàn)了邋ｆｌｏｔｍｉｎ－２這個(gè)蛋白在精子變形中起著非常重要方式與精子頂體生成過程中的高爾基復(fù)合體相關(guān)蛋白非常相似。該研ｉｌｌｉｎ－２可能參與小鼠精子頂體的形成［１３１逡逑ＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｍｉＲＮＡｓ）是一類在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的約由２１－２３內(nèi)源性、高保守、非編碼、單鏈小分子ＲＮＡ。它們可Ｗ通過完全或不對原則與靴基因ｍＲＮＡ的３’－非翻譯區(qū)（３’－ＵＴＲ）或５’－非翻譯區(qū)（５’－Ｕ錄后水平通過對鞭ｍＲＮＡ降解或者抑制翻譯過程從而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作等在秀麗新小桿線蟲的研究中首先發(fā)現(xiàn)了ｍｉＲＮＡ的存在ｔＷ，走在線蟲發(fā)育調(diào)控的研究中報(bào)道了第二個(gè)ｍｉＲＮＡ－－ｌｅｔ－７［＂］，從而揭開的序幕。在過去的幾十年里，人們發(fā)現(xiàn)ｍｉＲＮＡｓ在各種不同的生理和

睪丸網(wǎng)微注射技術(shù)注射針的制作。ａ圖為拉針儀，ｂ圖為磨針儀。逡逑注射前，所有操作過程中需要巧到的注射針、臥管、槍頭理，并經(jīng)高壓蒸汽滅菌消毒；逡逑管在拉針儀上拉成一定角度的注射針，然后在磨針儀上將于穿透組織壁，開口直徑約４０ｕｍ；逡逑的注射計(jì)尾部用打火機(jī)熏烤一下，，裝進(jìn)顯微操作臂，旋好鼠體重，按照體重用１％戊己比妥鋼腹腔注射麻醉小鼠，小于硬紙板上；逡逑除小鼠腹部的毛，隨后用９５％酒精消毒，逐層打開小鼠腹與睪丸相連的脂肪墊，輕輕將該脂肪墊拖出腹腔，小鼠的睪；逡逑０．２％臺盼藍(lán)作為指示劑的ｍｉＲＮＡ吸入注射針，約５ｕｌ三叉光源的亮度及顯微鏡的放大倍數(shù)（一般小于或等于２
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R698.2

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本文編號：2567178