【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病所致的全身微血管病變的腎臟表現(xiàn),主要以腎小球系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)沉積,腎小管上皮細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)分化,腎小球硬化和間質(zhì)纖維化為主要病理特征。DN的發(fā)病機制非常復(fù)雜,一直是國內(nèi)外腎臟病學(xué)領(lǐng)域研究的重點。過去十年的研究發(fā)現(xiàn),腎臟固有細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂是糖尿病腎損傷發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)。高糖狀態(tài)下脂質(zhì)成分在腎細(xì)胞內(nèi)異常沉積,可造成腎細(xì)胞的慢性功能紊亂和細(xì)胞損傷。用基因?qū)W或藥學(xué)方法干預(yù)糖尿病動物模型體內(nèi)脂質(zhì)生成基因的表達(dá),如固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBPs)及過氧化物酶增殖活化受體(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR),可改善糖尿病引起的腎臟損傷,說明脂質(zhì)代謝紊亂在DN發(fā)病過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interaction protein,TXNIP)或硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2,TBP-2),又稱維生素D3上調(diào)蛋白1(vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1)是一種內(nèi)在的硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)調(diào)節(jié)蛋白,其可與Trx結(jié)合而抑制其功能,從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生過氧化反應(yīng)。多項研究提示TXNIP參與了糖尿病腎病的發(fā)生,高糖能夠顯著上調(diào)腎臟細(xì)胞TXNIP蛋白和mRNA的表達(dá)。新近有研究顯示,TXNIP在肝臟脂代謝紊亂導(dǎo)致的脂肪肝方面發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用。在1型糖尿病相關(guān)的非酒精性脂肪性肝病大鼠模型中,伴隨肝臟脂質(zhì)沉積,TXNIP的表達(dá)明顯增高,中藥槲皮素和別嘌呤醇通過抑制肝臟TXNIP的表達(dá)減輕了肝臟的脂質(zhì)沉積。TXNIP基因敲除小鼠通過抑制PRMT1-PGC-1?信號途徑的激活改善了高脂飲食所致的脂肪肝。但TXNIP在糖尿病導(dǎo)致的腎臟脂質(zhì)沉積中是否也具有調(diào)節(jié)作用還未見報道。本研究應(yīng)用1型和2型兩種不同的糖尿病小鼠模型和體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2,從整體、細(xì)胞和分子等不同水平,系統(tǒng)全面地觀察了TXNIP在糖尿病腎臟脂質(zhì)沉積中的作用及調(diào)節(jié)機制,并觀察了天然抗氧化劑花青素對高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞txnip的表達(dá)及脂質(zhì)沉積的影響,為進(jìn)一步闡明糖尿病腎病的發(fā)病機制及其防治提供理論依據(jù)。方法:1糖尿病腎病患者腎組織txnip、srebp-1和ppar?的表達(dá)及脂質(zhì)沉積收集2010年10月~2014年10月在保定市第一中心醫(yī)院腎內(nèi)科住院,經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者20例(diabeticnephropathygroup),既往無其它腎臟病史,以10例腎臟腫瘤患者切除的腎臟遠(yuǎn)端瘤旁組織做為對照組(controlgroup)。留取血和尿標(biāo)本檢測血糖(glu)、糖化血紅蛋白(hba1c)、血膽固醇(tc)、血甘油三酯(tg)、24小時尿蛋白定量(upe)、肌酐(scr)、估算腎小球濾過率(egfr)等。采用油紅o染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴形成;免疫組織化學(xué)檢測txnip、srebp-1及ppar?蛋白表達(dá)。2txnip基因敲除對stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎組織脂質(zhì)沉積的影響6~8周齡c57bl/6j背景的野生型小鼠(wildtype)及txnip基因敲除鼠(txnip?/?)為動物模型。將實驗動物隨機分為4組,野生型c57bl/6j小鼠組(wt)、糖尿病組(wt+stz)、txnip基因敲除組(tko)和txnip基因敲除+糖尿病組(tko+stz)。每組10只,wt+stz和tko+stz組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,stz,溶于0.1mol/l枸櫞酸鹽緩沖液中,ph值4.5,50mg/kg/day),連續(xù)注射5天;對照組注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液,5天后血糖儀測定空腹血糖,血糖≥11.1mmol/l且尿糖陽性者(+++~++++)確定為dm模型。實驗期間動物自由進(jìn)食和飲水,每周測一次血糖。dm小鼠成模20周后處死小鼠,收集血尿標(biāo)本,用于生化指標(biāo)檢測,切取部分腎組織分別置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光鏡、免疫組織化學(xué)和電鏡檢測;部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及rna,westernblot檢測txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表達(dá),real-timepcr檢測srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表達(dá),油紅o染色檢測小鼠腎組織脂滴形成情況。3敲低txnip對高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞hk-2脂質(zhì)沉積的影響人腎小管上皮細(xì)胞hk-2在37°c,5%co2條件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴檢測高糖對hk-2細(xì)胞txnip表達(dá)和脂滴形成的影響:細(xì)胞分為正常糖對照組(5.5mmol/lglucose,ng)及高糖組(30mmol/lglucose,hg),刺激細(xì)胞,孵育0、6、12、24、48、72h后收集細(xì)胞,westernblot及real-timepcr檢測細(xì)胞txnip的表達(dá),油紅o染色檢測細(xì)胞脂滴形成。⑵檢測txnip對高糖誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響:使用fugene?hd轉(zhuǎn)染試劑將txnipshrnaplasmid(t)干擾質(zhì)粒和空白質(zhì)粒(v)分別轉(zhuǎn)染人腎小管上皮hk-2細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選濃度(4μg/ml)篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系。細(xì)胞隨機分為正常糖對照組(5.5mmol/lglucose,ng)、高滲對照組(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖組(30mmol/lglucose,hg)、高糖+空白質(zhì)粒組(30mmol/lglucose+vector,hg+v)、高糖+txnipshrna質(zhì)粒組(30mmol/lglucose+txnipshrna,hg+t)。細(xì)胞分組刺激48h后,westernblot檢測txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1、cpt1、p-akt、akt、p-mtor和mtor蛋白表達(dá);real-timepcr檢測txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ros的變化;油紅o染色檢測細(xì)胞脂滴形成;試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。⑶檢測pi3k/akt/mtor信號通路在高糖誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的意義:細(xì)胞隨機分為正常糖對照組(5.5mmol/lglucose,ng)、正常糖+ly294002組(5.5mmol/lglucose+10μmol/lly294002,ng+ly)、高滲對照組(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖組(30mmol/lglucose,hg)、高糖+ly294002組(30mmol/lglucose+10μmol/lly294002,hg+ly)。檢測方法及指標(biāo)同上。4天然抗氧化劑花青素對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞txnip的表達(dá)及脂質(zhì)沉積的影響①動物實驗:16只雄性db/db小鼠隨機抽取8只做為糖尿病腎病模型組(db/dbgroup,db/db)、余下8只為葡萄籽原花青素治療組(grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentgroup,db/db+gspe);16只db/m小鼠隨機抽取8只作為正常對照組(db/m),余下8只為葡萄籽原花青素治療對照組(grapeseedproanthocyanidinextracttreatmentcontrolgroup,db/m+gspe)。db/db+gspe組和db/m+gspe組給予5mg/kg/day葡萄籽原花青素灌胃,持續(xù)8周,對照組和模型組給予相同體積生理鹽水。實驗期間動物自由進(jìn)食和飲水,每2周測一次血糖及體重。小鼠15周齡時處死小鼠,收集血尿標(biāo)本,用于生化指標(biāo)檢測,切取部分腎組織分別置于4%多聚甲醛和4%的戊二醛固定液中固定,用于光鏡、免疫組織化學(xué)和電鏡檢測;部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及rna,westernblot檢測txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表達(dá),real-timepcr檢測srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1表達(dá),油紅o染色檢測小鼠腎組織脂滴形成情況。②細(xì)胞實驗:人腎小管上皮細(xì)胞hk-2在37°c,5%co2條件下,以含10%胎牛血清的dmem-f12培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴檢測花青素對hk-2細(xì)胞細(xì)胞活力及ros產(chǎn)生的影響:細(xì)胞用含10、20、50、100μm的c3g或cy刺激物的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h,mtt法檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ros的變化。⑵檢測花青素對高糖誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞txnip表達(dá)及脂質(zhì)沉積的影響:細(xì)胞隨機分為正常糖對照組(5.5mmol/lglucose,ng)、高滲對照組(5.5mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、高糖組(30mmol/lglucose,hg)、高糖+c3g組(30mmol/lglucose+c3g,hg+c3g)、高糖+cy組(30mmol/lglucose+cy,hg+cy)。細(xì)胞分組刺激48h后,westernblot檢測txnip、srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1蛋白表達(dá);real-timepcr檢測srebp-1、ppar?、fasn、acc、acox1和cpt1mrna表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ros的變化;油紅o染色檢測細(xì)胞脂滴形成。結(jié)果:1糖尿病腎病患者臨床病理表現(xiàn)及相關(guān)蛋白檢測①光鏡下觀察:對照組腎小球毛細(xì)血管袢開放良好,腎小管及間質(zhì)未見明顯異常;糖尿病腎病組腎小球體積增大,基底膜不規(guī)則增厚,系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生,晚期腎小球硬化;腎小管基底膜增厚,部分小管萎縮,部分小管代償性肥大,間質(zhì)纖維化。②糖尿病腎病組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多,而腎小球濾過率糖尿病腎病組患者比對照組下降(p0.05或p0.01)。③對照腎組織中未見明顯脂質(zhì)沉積,糖尿病腎病組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴,呈紅染顆粒狀。④免疫組化顯示,糖尿病腎病組txnip和srebp-1在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)增多,ppar?在腎小球及腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)減少,與對照組相比有顯著性差異(p0.01)。2txnip基因敲除對stz誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎組織脂質(zhì)沉積的影響①光鏡下觀察,糖尿病小鼠腎小球體積略增大,系膜細(xì)胞增生伴系膜基質(zhì)增多,基底膜不規(guī)則增厚,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性;txnip基因敲除明顯改善了糖尿病所致的腎臟形態(tài)學(xué)變化。②與wt小鼠相比,糖尿病小鼠bun、scr、tg及uae均顯著升高;txnip基因敲除各項指標(biāo)明顯下降(p0.05或p0.01)。③電鏡及油紅o染色顯示糖尿病小鼠近曲小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯的脂滴沉積,腎組織內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量明顯高于wt小鼠;txnip基因敲除的糖尿病小鼠小管細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)減少,甘油三酯及膽固醇含量降低(p0.01)。④與wt小鼠比較,糖尿病小鼠腎組織內(nèi)txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor表達(dá)明顯增高,而ppar?、cpt1及acox1的表達(dá)減少;txnip基因敲除下調(diào)了txnip、srebp-1、fasn、acc、p-akt及p-mtor的表達(dá),上調(diào)了ppar?、cpt1及acox1的表達(dá),均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05或p0.01)。3敲低txnip對高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞hk-2脂質(zhì)沉積的影響①與ng相比,hg組hk-2細(xì)胞中txnip表達(dá)明顯增高,呈時間依賴性;txnipshrna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯降低了hg誘導(dǎo)txnip蛋白的表達(dá)。油紅o染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)明顯增加,與刺激時間成正比。②txnipshrna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制了hg誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞脂滴形成及甘油三酯含量的增加(p0.01)。③與ng組相比,hg組srebp-1、fasn和acc表達(dá)明顯增加,akt和mtor的磷酸化水平升高,ppar?、cpt1及acox1表達(dá)減少;txnipshrna質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠降低hg誘導(dǎo)的srebp-1、fasn和acc表達(dá)增加及akt和mtor的磷酸化水平升高,上調(diào)ppar?、cpt1及acox1表達(dá)(p0.05或p0.01)。甘露醇及空白質(zhì)粒無影響。④與hg組相比,ly294002抑制了akt和mtor的磷酸化水平升高,降低srebp-1、fasn及acc的表達(dá),增加ppar?、cpt1及acox1的表達(dá);抑制了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的增加(p0.05或p0.01)。4天然抗氧化劑花青素對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞txnip的表達(dá)及脂質(zhì)沉積的影響①光鏡下觀察,db/db小鼠腎小球體積略增大,系膜細(xì)胞增生伴系膜基質(zhì)增多,基底膜不規(guī)則增厚,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性;葡萄籽原花青素(GSPE)干預(yù)明顯改善了糖尿病所致的腎臟形態(tài)學(xué)變化。與db/m小鼠相比,db/db小鼠FBG、BUN、Scr、TG、TC及UAE均顯著升高;葡萄籽原花青素(GSPE)干預(yù)各項指標(biāo)明顯下降(P0.05或P0.01)。②電鏡及油紅O染色顯示db/db小鼠近曲小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯的脂滴沉積,腎組織內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量明顯高于db/m小鼠;葡萄籽原花青素(GSPE)干預(yù)后脂滴數(shù)減少,甘油三酯及膽固醇含量降低。③與db/m小鼠比較,db/db小鼠腎組織內(nèi)TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC表達(dá)明顯增高,而PPAR?、CPT1及ACOX1的表達(dá)減少;葡萄籽原花青素(GSPE)干預(yù)后TXNIP、SREBP-1、FASN及ACC表達(dá)減少,PPAR?、CPT1及ACOX1的表達(dá)增加,均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01)。④花青素干預(yù)能夠明顯抑制HG誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TXNIP表達(dá)、ROS的生成及脂滴沉積(P0.05或P0.01)。⑤與NG組相比,HG組SREBP-1、FASN和ACC表達(dá)明顯增加,PPAR?、CPT1及ACOX1表達(dá)減少;花青素干預(yù)能夠降低HG誘導(dǎo)的SREBP-1、FASN和ACC表達(dá)增加,上調(diào)PPAR?、CPT1及ACOX1表達(dá)(P0.05或P0.01)。甘露醇及空白質(zhì)粒無影響。結(jié)論:1在糖尿病患者及小鼠模型腎組織和體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)高糖顯著誘導(dǎo)了TXNIP的表達(dá),同時腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積,提示TXNIP可能參與了腎小管上皮細(xì)胞異常的脂質(zhì)代謝過程。2 TXNIP基因敲除通過抑制脂肪酸合成相關(guān)蛋白的表達(dá)及增加脂肪酸?氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)減輕了糖尿病小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞脂質(zhì)異常沉積,這一作用可能是通過抑制Akt和mTOR的活化實現(xiàn)的。3花青素干預(yù)抑制糖尿病小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞TXNIP的高表達(dá),同時通過抑制脂肪酸合成相關(guān)蛋白的表達(dá)及增加脂肪酸?氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)減輕了小管細(xì)胞脂質(zhì)沉積,提示花青素可能部分通過抑制TXNIP的表達(dá)對DN脂代謝紊亂有改善作用。
【圖文】：

1-1 對照組及糖尿病腎病組腎組織 HE 染色(×400)E staining of renal tissues in control group and DN grouA: control group, B, C, D: DN group.

1-1 對照組及糖尿病腎病組腎組織 HE 染色(×400)E staining of renal tissues in control group and DN groupA: control group, B, C, D: DN group.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 張歡歡;劉楚新;馬月;肖麗萍;李飛達(dá);應(yīng)華忠;劉歡;;利用TALEN技術(shù)高效制備TXNIP基因敲除小鼠模型[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2015年06期

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本文編號：2565825