【摘要】：一、研究目的： 前列腺癌是全球中老年的常見惡性腫瘤，占全球范圍男性癌癥發(fā)病率的第二位，病死率則位居全球腫瘤的第六位。據(jù)報道，在歐洲每年有超過30萬的男性確診為前列腺癌。在美國，，男性好發(fā)的惡性腫瘤中，前列腺癌穩(wěn)居第一位，病死率占男性癌癥死亡率的第二位。我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率較低，但近年來前列腺癌的發(fā)病率明顯上升，近年的一些研究報道提示，上海地區(qū)前列腺癌以7.7/10萬的高發(fā)病率位居我國男性泌尿系腫瘤第一位。為此，前列腺癌已然成為當(dāng)今人們密切關(guān)注的疾病，同時也成為泌尿外科研究領(lǐng)域的一大熱點。 當(dāng)今，去勢治療仍是治療前列腺癌的標(biāo)尺。無論手術(shù)去勢還是藥物去勢均能達(dá)到大量殺死腫瘤細(xì)胞的效果，延緩前列腺癌的進(jìn)展。但一項研究表明，進(jìn)過治療后18~24個月，幾乎所有前列腺癌病人將由雄激素依賴型轉(zhuǎn)變?yōu)楦咔忠u性的去勢抵抗型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）。而其中很大一部分患者是在進(jìn)行二線激素治療的過程中逐漸發(fā)展為高侵襲激素抵抗型前列腺癌的，對于該種病人，目前仍缺少有效可行的治療方案。 NOB1蛋白（Nin one binding-1protein）是一種核糖體裝配蛋白，亦可以稱為捙帶蛋白，最早利用酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母菌26S蛋白酶體中。NOB1在真核生物的溶酶體合成以及核糖體形成過程中發(fā)揮著重要的作用。人類的NOB1基因包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，位于16號染色體長臂22.1位點上；它的cDNA長約1749bp，其開放閱讀框（open reading frame, ORF）位于33nt～1271nt。NOB1蛋白由總分子量約為46KDa的412個氨基酸組成。其N端存在一個由100個氨基酸構(gòu)成PIN（PiLT amino terminus）結(jié)構(gòu)，C端的第208～296位氨基酸則形成一個鋅帶結(jié)構(gòu)域（zinc ribbon domain）。兩種結(jié)構(gòu)域各司其職，他們分別在細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白形成、分解以及基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮不可小覷的作用。 NOB1蛋白在人類多種器官組織中均可見表達(dá)，但表達(dá)量各異，例如其在成人脾臟、肝和肺中含量最高，而在腎臟、前列腺、卵巢以及結(jié)腸中則表達(dá)較少。近年的一些研究提示，NOB1參與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，人為的敲除NOB1基因后能夠阻礙一些腫瘤細(xì)胞的增殖生長，如肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌腫瘤、甲狀腺乳頭狀癌、人膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌等，但有關(guān)NOB1對前列腺癌細(xì)胞，尤其對高侵襲性前列腺癌細(xì)胞（如PC-3和DU145）生長及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究至今少之又少。鑒于慢病毒載體的種種優(yōu)點，我們前期成功構(gòu)建了靶向敲減NOB1基因的shRNA慢病毒載體。并通過該載體研究NOB1表達(dá)水平的變化對高侵襲性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并為將來從NOB1靶向分子方向入手治療前列腺癌奠定了結(jié)實的基礎(chǔ)。 二、研究內(nèi)容及結(jié)果： （一）前列腺癌組織的各細(xì)胞系中NOB1的表達(dá)情況 為研究NOB1基因在前列腺癌中的功能，我們將抗-NOB1的抗體注入前列腺癌組織和鄰近正常組織中。與正常組織相比較，前列腺癌組織有著強(qiáng)烈的NOB1抗體的著色現(xiàn)象。q-PCR技術(shù)檢測7對前列腺癌組織中NOB1的水平，結(jié)果顯示，前列腺癌組織中NOB1的水平較正常組織有著顯著的增高現(xiàn)象。之后，我們對前列腺癌的各細(xì)胞系進(jìn)行了分析。DU145、PC-3和22RV1細(xì)胞系中NOB1的表達(dá)水平明顯高于雄激素敏感型的LNCap細(xì)胞系，其中LNCap侵略性和惡性程度較其他三種細(xì)胞系低。這些結(jié)果提示我們，NOB1基因與前列腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系，為后續(xù)進(jìn)一步研究NOB1對高侵襲性前列腺癌細(xì)胞（PC-3和DU145）的影響奠定基礎(chǔ)。 （二）NOB1基因在高侵襲性前列腺癌細(xì)胞中的敲減效率 前期工作中，我們成功構(gòu)建了靶向沉默NOB1基因的shRNA慢病毒，然后我們挑選上述NOB1表達(dá)水平相對高的PC-3和UD145細(xì)胞，用已經(jīng)構(gòu)建好的慢病毒對兩種前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行感染。轉(zhuǎn)染72小時后，我們通過綠色熒光蛋白（GFP）將慢病毒對兩種細(xì)胞的感染效率形象的表達(dá)出來。另外，我們分別利用蛋白印記（western blot）和qPCR技術(shù)對NOB1基因的敲減效率進(jìn)行蛋白水平和mRNA水平的分析，結(jié)果顯示shRNA慢病毒載體明顯下調(diào)了PC-3和DU145細(xì)胞中NOB1的表達(dá)。 （三）敲減NOB1基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3和DU145的生長增殖、 克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力的影響 在我們主要的實驗部分，我們通過慢病毒載體下調(diào)NOB1基因，來研究NOB1基因?qū)Ω咔忠u性前列腺癌腫瘤細(xì)胞生物學(xué)方面的影響。首先我們選擇PC-3和DU145前列腺癌細(xì)胞株，對經(jīng)Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染后的PC-3和DU145細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實驗。和對照組Lv-shcon轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞的生長明顯受到抑制。 為了評估NOB1在細(xì)胞集落形成中的功能，我們用Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染PC-3和DU145兩種細(xì)胞，并將它們置入6孔板中培養(yǎng)。15天后，培養(yǎng)出的克隆體用姬姆薩固定并著色。與對照組相比較，沉默NOB1基因?qū)е录湫纬审w積變小、分散且成團(tuán)能力差。 根據(jù)細(xì)胞周期各階段所含不同含量的DNA來對細(xì)胞周期分布進(jìn)行測定，我們利用流式細(xì)胞技術(shù)來進(jìn)一步分析NOB1在細(xì)胞周期進(jìn)程中的功能作用。和對照組對比，PC-3和DU145細(xì)胞中Lv-shNOB1組發(fā)生G0/G1期阻滯現(xiàn)象。另外，在S期兩種細(xì)胞的比例明顯減少。該結(jié)果表明，敲減NOB1會影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖生長。 最后，我們還設(shè)計了細(xì)胞遷移實驗，來研究敲減NOB1基因是否會對高侵襲性前列腺癌細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默NOB1基因后，PC-3和DU145兩種細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制。 三、結(jié)論： 綜上所述，為了闡明NOB1在人類前列腺惡性腫瘤中的功能作用，我們對前列腺癌細(xì)胞中NOB1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)NOB1在前列腺癌細(xì)胞組織中的表達(dá)水平明顯高于相鄰正常組織。之后通過創(chuàng)建沉默NOB1基因的shRNA慢病毒載體高效率感染激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145，并進(jìn)行細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移等實驗，我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)NOB1會導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、細(xì)胞增殖生長及克隆能力抑制，以及細(xì)胞的流動性降低等現(xiàn)象。因此，NOB1對前列腺癌的成瘤過程起著正相關(guān)作用。鑒于前列腺癌性質(zhì)轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不清楚，NOB1有可能成為將來抑制并治療高侵襲性前列腺癌疾病的一種新的靶向分子。
【圖文】：

- 17 -圖 1B，qRT-PCR 檢測前列腺癌及其癌旁組織中 NOB1 表達(dá)情況（P<0.01）結(jié)果顯示，與癌旁鄰近組織（Adjacent）比較，腫瘤組織（Pca）NOB1 表達(dá)水平顯著升高，P<0.01。

NOB1 基因在人高侵襲性前列腺癌細(xì)胞二、 實驗結(jié)果（一） NOB1 在前列腺癌與癌旁組織中的表達(dá)情1.免疫組化及 qRT-PCR 技術(shù)檢測前列腺組織中 NOB
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳東平;賀孝文;;結(jié)直腸癌中NOB1基因的表達(dá)及意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年03期

2 馬麗莉;王金勝;李代強(qiáng);霍小蕾;姬云霞;;NOB1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2011年06期

本文編號：2548692