【摘要】：一、研究目的： 前列腺癌是全球中老年的常見(jiàn)惡性腫瘤，占全球范圍男性癌癥發(fā)病率的第二位，病死率則位居全球腫瘤的第六位。據(jù)報(bào)道，在歐洲每年有超過(guò)30萬(wàn)的男性確診為前列腺癌。在美國(guó)，，男性好發(fā)的惡性腫瘤中，前列腺癌穩(wěn)居第一位，病死率占男性癌癥死亡率的第二位。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率較低，但近年來(lái)前列腺癌的發(fā)病率明顯上升，近年的一些研究報(bào)道提示，上海地區(qū)前列腺癌以7.7/10萬(wàn)的高發(fā)病率位居我國(guó)男性泌尿系腫瘤第一位。為此，前列腺癌已然成為當(dāng)今人們密切關(guān)注的疾病，同時(shí)也成為泌尿外科研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。 當(dāng)今，去勢(shì)治療仍是治療前列腺癌的標(biāo)尺。無(wú)論手術(shù)去勢(shì)還是藥物去勢(shì)均能達(dá)到大量殺死腫瘤細(xì)胞的效果，延緩前列腺癌的進(jìn)展。但一項(xiàng)研究表明，進(jìn)過(guò)治療后18~24個(gè)月，幾乎所有前列腺癌病人將由雄激素依賴(lài)型轉(zhuǎn)變?yōu)楦咔忠u性的去勢(shì)抵抗型前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）。而其中很大一部分患者是在進(jìn)行二線(xiàn)激素治療的過(guò)程中逐漸發(fā)展為高侵襲激素抵抗型前列腺癌的，對(duì)于該種病人，目前仍缺少有效可行的治療方案。 NOB1蛋白（Nin one binding-1protein）是一種核糖體裝配蛋白，亦可以稱(chēng)為捙帶蛋白，最早利用酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母菌26S蛋白酶體中。NOB1在真核生物的溶酶體合成以及核糖體形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。人類(lèi)的NOB1基因包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，位于16號(hào)染色體長(zhǎng)臂22.1位點(diǎn)上；它的cDNA長(zhǎng)約1749bp，其開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）位于33nt～1271nt。NOB1蛋白由總分子量約為46KDa的412個(gè)氨基酸組成。其N(xiāo)端存在一個(gè)由100個(gè)氨基酸構(gòu)成PIN（PiLT amino terminus）結(jié)構(gòu)，C端的第208～296位氨基酸則形成一個(gè)鋅帶結(jié)構(gòu)域（zinc ribbon domain）。兩種結(jié)構(gòu)域各司其職，他們分別在細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白形成、分解以及基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮不可小覷的作用。 NOB1蛋白在人類(lèi)多種器官組織中均可見(jiàn)表達(dá)，但表達(dá)量各異，例如其在成人脾臟、肝和肺中含量最高，而在腎臟、前列腺、卵巢以及結(jié)腸中則表達(dá)較少。近年的一些研究提示，NOB1參與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，人為的敲除NOB1基因后能夠阻礙一些腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，如肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌腫瘤、甲狀腺乳頭狀癌、人膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌等，但有關(guān)NOB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞，尤其對(duì)高侵襲性前列腺癌細(xì)胞（如PC-3和DU145）生長(zhǎng)及相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究至今少之又少。鑒于慢病毒載體的種種優(yōu)點(diǎn)，我們前期成功構(gòu)建了靶向敲減NOB1基因的shRNA慢病毒載體。并通過(guò)該載體研究NOB1表達(dá)水平的變化對(duì)高侵襲性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并為將來(lái)從NOB1靶向分子方向入手治療前列腺癌奠定了結(jié)實(shí)的基礎(chǔ)。 二、研究?jī)?nèi)容及結(jié)果： （一）前列腺癌組織的各細(xì)胞系中NOB1的表達(dá)情況 為研究NOB1基因在前列腺癌中的功能，我們將抗-NOB1的抗體注入前列腺癌組織和鄰近正常組織中。與正常組織相比較，前列腺癌組織有著強(qiáng)烈的NOB1抗體的著色現(xiàn)象。q-PCR技術(shù)檢測(cè)7對(duì)前列腺癌組織中NOB1的水平，結(jié)果顯示，前列腺癌組織中NOB1的水平較正常組織有著顯著的增高現(xiàn)象。之后，我們對(duì)前列腺癌的各細(xì)胞系進(jìn)行了分析。DU145、PC-3和22RV1細(xì)胞系中NOB1的表達(dá)水平明顯高于雄激素敏感型的LNCap細(xì)胞系，其中LNCap侵略性和惡性程度較其他三種細(xì)胞系低。這些結(jié)果提示我們，NOB1基因與前列腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展存在一定的聯(lián)系，為后續(xù)進(jìn)一步研究NOB1對(duì)高侵襲性前列腺癌細(xì)胞（PC-3和DU145）的影響奠定基礎(chǔ)。 （二）NOB1基因在高侵襲性前列腺癌細(xì)胞中的敲減效率 前期工作中，我們成功構(gòu)建了靶向沉默NOB1基因的shRNA慢病毒，然后我們挑選上述NOB1表達(dá)水平相對(duì)高的PC-3和UD145細(xì)胞，用已經(jīng)構(gòu)建好的慢病毒對(duì)兩種前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行感染。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，我們通過(guò)綠色熒光蛋白（GFP）將慢病毒對(duì)兩種細(xì)胞的感染效率形象的表達(dá)出來(lái)。另外，我們分別利用蛋白印記（western blot）和qPCR技術(shù)對(duì)NOB1基因的敲減效率進(jìn)行蛋白水平和mRNA水平的分析，結(jié)果顯示shRNA慢病毒載體明顯下調(diào)了PC-3和DU145細(xì)胞中NOB1的表達(dá)。 （三）敲減NOB1基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞PC-3和DU145的生長(zhǎng)增殖、 克隆形成能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力的影響 在我們主要的實(shí)驗(yàn)部分，我們通過(guò)慢病毒載體下調(diào)NOB1基因，來(lái)研究NOB1基因?qū)Ω咔忠u性前列腺癌腫瘤細(xì)胞生物學(xué)方面的影響。首先我們選擇PC-3和DU145前列腺癌細(xì)胞株，對(duì)經(jīng)Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染后的PC-3和DU145細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。和對(duì)照組Lv-shcon轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。 為了評(píng)估NOB1在細(xì)胞集落形成中的功能，我們用Lv-shNOB1轉(zhuǎn)染PC-3和DU145兩種細(xì)胞，并將它們置入6孔板中培養(yǎng)。15天后，培養(yǎng)出的克隆體用姬姆薩固定并著色。與對(duì)照組相比較，沉默NOB1基因?qū)е录湫纬审w積變小、分散且成團(tuán)能力差。 根據(jù)細(xì)胞周期各階段所含不同含量的DNA來(lái)對(duì)細(xì)胞周期分布進(jìn)行測(cè)定，我們利用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)進(jìn)一步分析NOB1在細(xì)胞周期進(jìn)程中的功能作用。和對(duì)照組對(duì)比，PC-3和DU145細(xì)胞中Lv-shNOB1組發(fā)生G0/G1期阻滯現(xiàn)象。另外，在S期兩種細(xì)胞的比例明顯減少。該結(jié)果表明，敲減NOB1會(huì)影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。 最后，我們還設(shè)計(jì)了細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究敲減NOB1基因是否會(huì)對(duì)高侵襲性前列腺癌細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默NOB1基因后，PC-3和DU145兩種細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制。 三、結(jié)論： 綜上所述，為了闡明NOB1在人類(lèi)前列腺惡性腫瘤中的功能作用，我們對(duì)前列腺癌細(xì)胞中NOB1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)NOB1在前列腺癌細(xì)胞組織中的表達(dá)水平明顯高于相鄰正常組織。之后通過(guò)創(chuàng)建沉默NOB1基因的shRNA慢病毒載體高效率感染激素非依賴(lài)性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145，并進(jìn)行細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移等實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)NOB1會(huì)導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控紊亂、細(xì)胞增殖生長(zhǎng)及克隆能力抑制，以及細(xì)胞的流動(dòng)性降低等現(xiàn)象。因此，NOB1對(duì)前列腺癌的成瘤過(guò)程起著正相關(guān)作用。鑒于前列腺癌性質(zhì)轉(zhuǎn)變的機(jī)制尚不清楚，NOB1有可能成為將來(lái)抑制并治療高侵襲性前列腺癌疾病的一種新的靶向分子。
【圖文】：

- 17 -圖 1B，qRT-PCR 檢測(cè)前列腺癌及其癌旁組織中 NOB1 表達(dá)情況（P<0.01）結(jié)果顯示，與癌旁鄰近組織（Adjacent）比較，腫瘤組織（Pca）NOB1 表達(dá)水平顯著升高，P<0.01。

NOB1 基因在人高侵襲性前列腺癌細(xì)胞二、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一） NOB1 在前列腺癌與癌旁組織中的表達(dá)情1.免疫組化及 qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)前列腺組織中 NOB
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳東平;賀孝文;;結(jié)直腸癌中NOB1基因的表達(dá)及意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年03期

2 馬麗莉;王金勝;李代強(qiáng);霍小蕾;姬云霞;;NOB1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2011年06期

本文編號(hào)：2548692