發(fā)布時間：2019-09-26 02:30

【摘要】：糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥,也是最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致終末期腎病的第二位病因。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對糖尿病腎病的治療主要是對癥治療,副作用比較大,患者依從性比較差。晚期行血液透析或腎臟移植術(shù),腎源缺乏,價格昂貴,患者難以接受。中醫(yī)藥在治療糖尿病腎病方面具有一定的優(yōu)勢,顯示出較大的潛力及廣闊的應(yīng)用前景。腎絡(luò)安方是全國名老中醫(yī)萬政主任中醫(yī)師臨床經(jīng)驗方,在治療糖尿病腎病方面取得了良好的療效,為進一步驗證該方的治療作用,探討其作用機制,開展此項研究。本實驗采用高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方式,建立糖尿病腎病動物模型,給予腎絡(luò)安方及厄貝沙坦干預(yù)治療,觀察PI3K/Akt/m TOR信號通路下足細(xì)胞Integrinβ1的表達(dá),觀察高糖條件下對足細(xì)胞增殖的影響及腎絡(luò)安方的干預(yù)作用,并開展腎絡(luò)安方的臨床實驗研究,為糖尿病腎病的中藥治療提供動物、細(xì)胞及臨床實驗數(shù)據(jù)。第一部分腎絡(luò)安方對糖尿病腎病大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)的影響目的:建立糖尿病腎病動物模型,觀察大鼠一般情況,腎臟病理形態(tài),腎功能、血糖、血脂及纖維化指標(biāo)的改變,以驗證腎絡(luò)安方對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用。方法:雄性SD大鼠90只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,檢測血糖及尿蛋白,均為陰性者進入實驗。隨機選取對照組10只,給予普通飼料喂養(yǎng)。其余80只大鼠為造模組,給予高脂飼料飼養(yǎng)。造模組大鼠飼養(yǎng)12周后一次性腹腔注射STZ 35mg·kg-1,對照組給予注射相應(yīng)體積0.1mol·L-1枸櫞酸緩沖液。72h后造模組大鼠行尾靜脈采血,以三次尾靜脈空腹測血糖值均≥16.7 mmol/L為糖尿病造模初步成功。造模成功的大鼠隨機分為模型組19只、厄貝沙坦組19只、中藥組19只和中藥聯(lián)合厄貝沙坦組20只。造模成功一周后開始給藥。厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦15.75mg·kg-1·d-1灌胃。中藥組給予10.44g·kg-1·d-1灌胃,聯(lián)合組按上述中藥組及厄貝沙坦組的給藥方法聯(lián)合應(yīng)用。對照組及模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。灌胃開始之日起記為第1天。每日一次,連續(xù)灌胃16周。觀察大鼠一般狀況、腎臟相關(guān)指標(biāo)、病理組織形態(tài)學(xué)變化、腎小球基底膜形態(tài)學(xué)變化的影響等。結(jié)果:1實驗大鼠一般情況共70只大鼠進入實驗結(jié)果分析,其中對照組10只,模型組14只,厄貝沙坦組15只,中藥組15只,聯(lián)合組16只。2各組大鼠雙腎重量/體重(KI)的比較與對照組相比,模型組及各治療組KI明顯升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組KI降低(P0.05)。各治療組間比較,KI無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3各組大鼠不同時間點空腹血糖(FBG)的比較與對照組相比,模型組及各治療組FBG在不同時間點均明顯升高(P0.05)。與模型組相比,中藥組、聯(lián)合組均在12w、16w FBG明顯降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組在16w FBG明顯降低(P0.05)。4各組大鼠糖化血紅蛋白(Hb A1c)的比較與對照組相比,模型組及各治療組Hb A1c明顯升高(P0.05)。與模型組相比,中藥組、聯(lián)合組Hb A1c值明顯降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組Hb A1c值明顯降低(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組Hb A1c值明顯降低(P0.05)。5各組大鼠穩(wěn)態(tài)模式評估法測定胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)的比較16w Homa-IR水平比較:與對照組相比,模型組及各治療組Homa-IR明顯升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組Homa-IR降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組Homa-IR明顯降低(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組Homa-IR值降低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。6各組大鼠不同時間點24h尿蛋白定量情況的比較對照組24h尿蛋白定量最低,并保持穩(wěn)定(P0.05)。與對照組相比,模型組及各治療組在4w、8w、12w、16w 24h尿蛋白定量均增高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。模型組尿蛋白定量在不同時間點逐步增高。與模型組相比,各治療組在8w、12w、16w檢測尿蛋白定量明顯減低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組在16w檢測顯示尿蛋白定量明顯降低(P0.05)。7各組大鼠腎功能的比較UA水平比較:與對照組相比,模型組及各治療組UA均有不同程度增高(P0.05)。與模型組相比,各治療組UA均有降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組UA降低更明顯(P0.05)。Scr水平比較:與對照組相比,模型組及各治療組Scr增高(P0.05)。與模型組相比,各治療組Scr降低(P0.05)。各治療組之間Scr比較,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。BUN水平比較:與對照組相比,模型組及各治療組BUN明顯升高(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組BUN降低明顯(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組BUN明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。8各組大鼠TP、ALB的比較TP比較:與對照組相比,模型組及各治療組TP水平明顯降低(P0.05)。與模型組相比,各治療組TP水平升高(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組TP升高(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組TP升高明顯(P0.05)。ALB比較:與對照組相比,模型組及各治療組ALB水平明顯降低(P0.05)。與模型組相比,各治療組ALB水平升高(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組ALB升高明顯(P0.05)。9各組大鼠血脂的比較TC比較:與對照組相比,模型組及各治療組TC水平升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組TC水平降低(P0.05)。各治療組之間TC水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。TG比較:與對照組相比,模型組及各治療組TG水平升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組TG水平降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組TG明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。HDL比較:各組HDL相比,無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。VLDL比較:與對照組相比,模型組及各治療組VLDL水平明顯升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組VLDL水平降低(P0.05)。各治療組之間VLDL水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。10各組大鼠纖維化水平比較LN比較:與對照組相比,模型組及各治療組LN水平升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組LN水平降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組LN降低明顯(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組LN降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。IV-C比較:與對照組相比,模型組及各治療組IV-C水平升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組IV-C水平降低(P0.05)。各治療組之間IV-C水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。11光鏡結(jié)果對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠腎小球體積肥大,腎小囊腔狹窄呈裂隙狀,腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚,系膜基質(zhì)增多,系膜區(qū)增寬,腎小球上皮細(xì)胞排列紊亂,肥大,部分上皮細(xì)胞空泡樣變。與模型組相比,厄貝沙坦組、中藥組、聯(lián)合組腎臟病變均有改善。而尤以聯(lián)合組改善更明顯。12電鏡結(jié)果對照組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。模型組腎小球毛細(xì)血管基底膜勻質(zhì)性增厚,結(jié)構(gòu)欠清晰,系膜基質(zhì)增多,足突增寬或廣泛融合。厄貝沙坦組、中藥組、聯(lián)合組腎小球毛細(xì)血管基底膜節(jié)段性增厚,足突節(jié)段性融合。而聯(lián)合組的病理改善明顯。第二部分腎絡(luò)安方通過PI3K/Akt/m TOR通路上調(diào)糖尿病腎病大鼠Integrinβ1表達(dá)目的:建立糖尿病腎病大鼠模型,觀察腎臟PI3K/Akt/m TOR信號通路相關(guān)因子的表達(dá)及足細(xì)胞Intgrinβ1的表達(dá),以驗證PI3K/Akt/m TOR信號通路是否參與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷,以及腎絡(luò)安方及厄貝沙坦對糖尿病腎病腎臟的保護作用的具體機制。方法:同上方法復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型,采用免疫組織化學(xué)方法檢測Integrinβ1、PTEN、p-Akt、p-m TOR在腎臟組織定位表達(dá),采用Western blot方法檢測Integrinβ1、PTEN、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR在蛋白水平的表達(dá),采用real-time RT PCR檢測Integrinβ1、PTEN、IV-C在轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果:1腎組織中Integrinβ1蛋白及m RNA表達(dá)的比較 免疫組織化學(xué)結(jié)果:與對照組相比,模型組Integrinβ1在腎小球中表達(dá)明顯減少,腎小管染色減輕,而各治療組較模型組表達(dá)增強,尤以聯(lián)合組改善明顯,稍強陽性表達(dá)。Western blot及Real-time RT-PCR結(jié)果:與對照組比較,模型組及各治療組的Integrinβ1蛋白及m RNA表達(dá)水平明顯減低(P0.05);與模型組相比,各治療組Integrinβ1蛋白及m RNA表達(dá)水平明顯升高(P0.05),尤以聯(lián)合組表達(dá)升高更明顯(P0.05)。2腎組織中PTEN蛋白及m RNA表達(dá)的比較免疫組織化學(xué)結(jié)果:PTEN在對照組大鼠細(xì)胞漿中普遍表達(dá),在細(xì)胞核中少量表達(dá)。與對照組相比,模型組PTEN少量陽性表達(dá)。而各治療組表達(dá)較模型組增強,尤而聯(lián)合組強陽性表達(dá)。Western blot及Real-time RT-PCR結(jié)果:與對照組比較,模型組及各治療組PTEN蛋白及m RNA表達(dá)水平明顯降低(P0.05),以模型組表達(dá)最低(P0.05);與模型組相比,各治療組PTEN蛋白及m RNA表達(dá)水平均明顯增高(P0.05),尤以聯(lián)合組升高更明顯(P0.05)。3腎組織中Akt蛋白表達(dá)的比較Western blot結(jié)果:各組Akt蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。4腎組織中p-Akt蛋白表達(dá)的比較免疫組織化學(xué)結(jié)果:p-Akt主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿與胞核中。以細(xì)胞胞漿及胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性信號。對照組腎小球內(nèi)p-Akt表達(dá)較少,而模型組及各治療組腎小球內(nèi)p-Akt表達(dá)增強。與模型組相比,各治療組腎小球內(nèi)p-Akt表達(dá)減弱,尤以聯(lián)合組p-Akt表達(dá)減弱更明顯。Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,模型組及各治療組p-Akt/Akt升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組p-Akt/Akt降低(P0.05),尤以聯(lián)合組p-Akt/Akt降低更明顯(P0.05)。5腎組織中m TOR蛋白表達(dá)的比較Western blot檢測結(jié)果顯示:各組m TOR蛋白表達(dá)無明顯差異(P0.05)。6腎組織中p-m TOR蛋白表達(dá)的比較免疫組織化學(xué)結(jié)果:p-m TOR主要表達(dá)在腎小球系膜基質(zhì)及腎小管-間質(zhì)。對照組細(xì)胞胞漿及胞核中有少量p-m TOR蛋白表達(dá),而模型組及各治療組p-m TOR蛋白表達(dá)增強。與模型組相比,各治療組p-m TOR表達(dá)減弱,尤以聯(lián)合組p-m TOR表達(dá)減弱更明顯。Western blot檢測結(jié)果顯示:與對照組相比,模型組及各治療組p-m TOR/m TOR升高(P0.05)。與模型組相比,各治療組p-m TOR/m TOR降低(P0.05),尤以聯(lián)合組p-m TOR/m TOR降低更明顯(P0.05)。7腎組織中IV-C m RNA比較Real-Time RT-PCR法檢測結(jié)果顯示:與對照組比較,模型組及各治療組IV-C m RNA表達(dá)水平升高(P0.05);與模型組相比,各治療組IV-C m RNA表達(dá)水平降低(P0.05)。與厄貝沙坦組相比,聯(lián)合組IV-C m RNA降低(P0.05)。與中藥組相比,聯(lián)合組IV-C m RNA表達(dá)降低(P0.05)。第三部分腎絡(luò)安方促進高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞增殖目的:體外培養(yǎng)足細(xì)胞,予高糖條件造成腎小球足細(xì)胞損傷,以厄貝沙坦為對照組,觀察腎絡(luò)安方對高糖環(huán)境下腎小球足細(xì)胞增殖的影響方法:15只SD大鼠隨機分為3組,對照組,腎絡(luò)安組,厄貝沙坦組,對照組給予蒸餾水灌胃,腎絡(luò)安組及厄貝沙坦組均按成人臨床用量的20倍灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃4天,取血清。采用5%中藥含藥血清對足細(xì)胞進行干預(yù),用MTT法檢測對照組、高糖組、厄貝沙坦組、腎絡(luò)安組足細(xì)胞在不同時間點12h、24h、36h、48h的增殖情況。結(jié)果:與對照組相比,高糖組足細(xì)胞在36h OD值明顯降低(P0.05),說明高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖受到一定抑制作用。與高糖組相比,厄貝沙坦組足細(xì)胞在36h、48h OD值明顯升高(P0.05),腎絡(luò)安方組在48h OD值明顯升高(P0.05),說明腎絡(luò)安方、厄貝沙坦對高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖具有一定的促進作用。而腎絡(luò)安方組48h OD值與厄貝沙坦組48h OD值無明顯差異,說明隨著時間的延長,腎絡(luò)安方與厄貝沙坦對高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖的促進作用無明顯差異(P0.05)。第四部分腎絡(luò)安方治療肥胖型早期糖尿病腎病臨床觀察目的:開展腎絡(luò)安方治療肥胖型早期糖尿病腎病臨床實驗研究,觀察治療效果及不良反應(yīng)情況,為開發(fā)中藥提供臨床數(shù)據(jù)。方法:選取肥胖型早期DN患者68例,隨機分為治療組34例和對照組34例。對照組在基礎(chǔ)治療基礎(chǔ)上給予厄貝沙坦片150mg口服,治療組在對照組基礎(chǔ)上服用協(xié)定處方腎絡(luò)安方400ml,分早晚2次溫服,每日1劑。兩組患者共治療16周。檢測各項指標(biāo),評價療效。觀察治療前后中醫(yī)證候積分、腰圍、血液相關(guān)指標(biāo)(SCr、BUN、TC、TG、FBG、Hb A1c、Cys C、β2-MG、Hcy),及尿液相關(guān)指標(biāo)(UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR、UPCX/UCR、UNephrin/UCR)。結(jié)果:1治療組和對照組一般資料分布均勻,無統(tǒng)計學(xué)差異。2兩組臨床療效的比較63例病例完成實驗。治療組總有效率為90.62%;對照組總有效率為67.74%。治療組總有效率明顯高于對照組(P0.05)。3兩組中醫(yī)證候積分的比較兩組治療前各項癥狀比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。治療組治療后各項癥狀改善明顯優(yōu)于對照組治療后(P0.05)。4兩組腰圍的比較兩組腰圍比較無顯著性差異(P0.05)。5兩組治療前后血SCr、BUN、TC、TG、FBG、Hb A1c的比較兩組指標(biāo)治療前比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);治療組治療后各項指標(biāo)均有改善(P0.05),其中SCr、TC、TG、FBG、Hb A1c較對照組治療后明顯降低(P0.05)。6兩組治療前后血Cys C、β2-MG、Hcy的比較兩組Cys C、β2-MG、Hcy指標(biāo)治療前比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);治療后兩組指標(biāo)均有降低(P0.05),而治療組治療后較對照組治療后各項指標(biāo)降低更明顯(P0.05)。7兩組治療前后UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR的比較治療組治療后UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR較本組治療前降低(P0.05),較對照組治療后明顯降低(P0.05)。8 UMCP-1/UCR、URANTES/UCR、UACR相關(guān)性分析UMCP-1/UCR與URANTES/UCR成正相關(guān)(r=0.561P=0.000)。UACR與UMCP-1/UCR成正相關(guān)(r=0.560P=0.000)。UACR與URANTES/UCR成正相關(guān)(r=0.489P=0.000)。9兩組治療前后UPCX/UCR、UNephrin/UCR比較 對照組及治療組治療后UPCX/UCR、UNephrin/UCR均較本組治療前降低(P0.05),治療組治療后較對照組治療后降低更明顯(P0.05)。10 UPCX/UCR、UNephrin/UCR、UACR相關(guān)性分析UPCX/UCR、UNephrin/UCR呈正相關(guān)(r=0.474P0.05)。UPCX/UCR、UACR呈正相關(guān)(r=0.447P0.05)。UNephrin/UCR、UACR呈正相關(guān)(r=0.473P0.05)。11兩組安全性指標(biāo)的檢測安全性指標(biāo)檢測未發(fā)現(xiàn)明顯異常。結(jié)論:1腎絡(luò)安方能改善糖尿病腎病大鼠一般狀況,減少尿蛋白排泄,改善腎臟功能,減輕腎臟病理損害,進而延緩腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展。2糖尿病腎病腎臟PI3K/Akt/m TOR通路被激活,IV-C膠原合成增加,細(xì)胞外基質(zhì)積聚,足細(xì)胞Integrinβ1表達(dá)減弱,抑制足細(xì)胞增殖,促進腎小球硬化。而腎絡(luò)安方能抑制PI3K/Akt/m TOR通路活化,抑制IV-C膠原合成,上調(diào)足細(xì)胞Integrinβ1表達(dá),促進足細(xì)胞增殖,這可能是其發(fā)揮腎臟保護作用的機制之一。3腎絡(luò)安方可顯著改善肥胖型早期糖尿病腎病患者的臨床癥狀、體征,減少UMCP-1、URANTES、UACR、UPCX、UNephrin的排泄,保護腎功能,為糖尿病腎病的防治提供了新的治療方案。4腎絡(luò)安方聯(lián)合厄貝沙坦治療糖尿病腎病具有較好的療效,但由于患者例數(shù)的局限性,有待于今后的研究中繼續(xù)加大樣本量,從而更加有力的證明其安全性。
【圖文】：

圖 1 各組大鼠不同時間點體重情況比較（g）（χ± s）相比，*P＜0.05； 與模型組相比，，△P＜0.05；與厄貝0.05ig.1 Comparison of body weight (g) in rats at different tim vs Control,△P<0.05 vs Model,#P<0.05 vs Irbesartan

各組大鼠不同時間點體重情況比較（g）（χ±s）
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2541773