【摘要】：第一部分SD大鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定及大鼠急性缺血性腎損傷模型的建立目的：脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ASCs)分離培養(yǎng)和鑒定：建立大鼠急性缺血性腎損傷(ischemic acute kidney injury)模型。方法：采用Ⅰ型膠原酶消化法獲取SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中的ASCs,貼壁法純化,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長過程,取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。體外標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)下檢測此類細(xì)胞成脂、成骨等多向分化能力,并以FCM儀檢測其表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34和CD45。以無創(chuàng)動脈夾持續(xù)夾閉雙側(cè)腎蒂45min的方法建立大鼠iAKI模型,并檢測正常大鼠和iAKI大鼠再灌注24hr時的血肌酐(Scr)。結(jié)果：1.原代細(xì)胞呈短梭形或小多角形,貼壁集落生長,貼壁細(xì)胞經(jīng)3次傳代后,細(xì)胞大小及形態(tài)趨于一致,呈長梭形旋渦狀、放射狀生長。2.FCM鑒定ASCs細(xì)胞表面抗原,結(jié)果顯示CD29和CD90高表達(dá),CD34和CD45低表達(dá),符合ASCs公認(rèn)的免疫表型；在標(biāo)準(zhǔn)成脂誘導(dǎo)條件下,油紅O染色可見脂肪滴證實(shí)其可向脂肪細(xì)胞分化；在標(biāo)準(zhǔn)成骨誘導(dǎo)條件下,Von Kossa染色可見礦化結(jié)節(jié)證實(shí)其可向成骨細(xì)胞分化。3ASCs傳至第9代仍可保持平均每天1.33×104個的增值速度。4.正常大鼠血肌酐為41.67±5.92μmol/L, iAKI大鼠再灌注24hr時的血肌酐為261.99±5.09μmol/L。結(jié)論：1.通過Ⅰ型膠原酶消化法可獲得較高純度的大鼠ASCs,細(xì)胞貼壁生長并且高表達(dá)CD29和CD90,低表達(dá)CD34和CD45,符合公認(rèn)的ASCs免疫表型。2.分離獲得的ASCs在標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞,多向分化潛能證實(shí)其為干細(xì)胞。3.大鼠腹股溝處皮下脂肪組織中提取的ASCs自我更新能力旺盛,傳至第9代仍可保持較快增殖速度。4. iAKI大鼠24hr時血肌酐較正常大鼠顯著升高(P0.05),iAKI模型建立成功。第二部分經(jīng)左側(cè)腎動脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷的治療作用研究目的：探討經(jīng)左側(cè)腎動脈移植ASCs對大鼠急性缺血性腎損傷(iAKI)的治療作用。方法：持續(xù)夾閉SD大鼠雙側(cè)腎蒂45min建立iAKI模型。將建模成功后的SD大鼠隨機(jī)分成兩組：對照組(再灌注后即刻經(jīng)左腎動脈注射500μ1PBS, n=30)、ASCs治療組(再灌注后即刻經(jīng)腎動脈移植5x105 ASCs, n=30)。術(shù)后12、24、48、72hr和1wk時處死大鼠,取血、分離血清,分別測定血清肌酐值,光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理損傷及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增生情況,并進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評分和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：1ASCs治療組Scr水平在各時間點(diǎn)均顯著低于對照組(P0.05)。2.腎臟病理及腎小管間質(zhì)損傷評分提示：與對照組相比,治療組再灌注12、24和48hr時損傷顯著減輕。3.與對照組相比,治療組左側(cè)腎臟TUNEL染色和巨噬細(xì)胞浸潤染色積分再灌注12、24、48、72hr和1wk時顯著降低(P0.05)；核增殖抗原48hr時顯著增加(P0.05),72hr和1wk時減少(P0.05)。與治療組右側(cè)腎臟相比,治療組左側(cè)腎臟于再灌注后24hr腎小管間質(zhì)損傷評分顯著降低(2.40±0.50,P0.05),再灌注后1wk時,腎組織TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)減少(P0.05),再灌注12、48、72hr和1wk時巨噬細(xì)胞浸潤染色積分減少(P0.05),再灌注后48hr時核增殖抗原表達(dá)增加(P0.05),再灌注后72hr和1 wk時核增殖抗原表達(dá)減少(P0.05)。結(jié)論：ASCs經(jīng)腎動脈移植可顯著改善iAKI大鼠腎功能、減輕腎臟病理損傷和細(xì)胞凋亡、減少炎癥細(xì)胞浸潤、促進(jìn)損傷后修復(fù)。此外,直接移植ASCs的左腎在細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤、損傷修復(fù)方面均優(yōu)于右腎,提示ASCs進(jìn)入受損部位或受損附近部位后發(fā)揮了重要作用。第三部分經(jīng)左側(cè)腎動脈移植后的ASCs在AKI大鼠體內(nèi)分布情況研究目的：研究標(biāo)記后的ASCs經(jīng)大鼠左側(cè)腎動脈移植后在AKI大鼠體內(nèi)分布情況。方法：選擇CM-Dil標(biāo)記ASCs,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。參照第二部分方法制作大鼠iAKI模型,再灌注后即刻經(jīng)左腎動脈移植5×105 CM-Dil標(biāo)記的ASCs,術(shù)后12、24、48、72hr和1wk時處死大鼠,制作冰凍切片,DAPI標(biāo)記細(xì)胞核,熒光倒置顯微鏡觀察腎、肺、肝、脾、心臟內(nèi)的CM-Dil陽性細(xì)胞的分布情況,并計(jì)數(shù)不同時間點(diǎn)雙側(cè)腎臟單個腎小球內(nèi)平均ASCs數(shù)量。結(jié)果：1ASCs腎內(nèi)分布情況：CM-Dil陽性細(xì)胞主要分布于左側(cè)腎小球內(nèi),其中移植后12hr和24hrASCs較多,48hr、72hr和1wk時ASCs數(shù)量逐漸減少：右腎所有時間點(diǎn)均未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞。2.ASCs在肺、肝、脾、心臟的分布情況：48hr、72hr時肺內(nèi)存在少量CM-Dil陽性細(xì)胞,12hr、24hr、1wk時未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞；48hr肝內(nèi)存在少量CM-Dil陽性細(xì)胞,其他時間點(diǎn)未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞：脾臟和心臟在各時間點(diǎn)均未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞。2.12hr、24hr、48hr、 72hr、1wk時單個腎小球內(nèi)CM-Dil陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為：6.33+1.75、5.67±1.15、4.5±1.05、3.43±1.06、2.5±1.29個。結(jié)論：1.選擇CM-Dil標(biāo)記ASCs,進(jìn)行體內(nèi)示蹤并觀察其分布情況是可行的。2.經(jīng)左側(cè)腎動脈移植的ASCs全部分布在左側(cè)腎小球內(nèi),右側(cè)腎小球在各個時間點(diǎn)均未觀察到CM-Dil陽性細(xì)胞。3.腎動脈移植途徑可有效減少ASCs在其他臟器的滯留,提高歸巢率,發(fā)揮治療作用。
【圖文】：

細(xì)胞形狀也由原來的梭形變?yōu)轭悎A形或多角形，，隨誘導(dǎo)時間的延長，逡逑出現(xiàn)脂滴的細(xì)胞逐漸增多。誘導(dǎo)８ｄ后，細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)充滿圓形脂滴，呈逡逑葡萄串狀（圖１－３Ａ）。這時進(jìn)行油紅０染色可見：圓形細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)亮紅色的顆粒，逡逑證明胞漿內(nèi)容物確為脂肪滴（國１－３Ｂ）。對照紐無明顯變化，仍為梭形細(xì)胞，未逡逑見胞漿內(nèi)脂滴。逡逑４．邐ＡＳＣｓ的成骨誘導(dǎo)逡逑成骨誘導(dǎo)：１８ｄ后，倒置顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由梭逡逑形轉(zhuǎn)化為多角形，且胞體增大，突起增多，胞核變大變圓，胞漿中可見細(xì)小黑色逡逑顆粒．細(xì)胞常圍繞集落中央呈島狀分布煙１－４Ａ）。取成骨誘導(dǎo)１８ｄ的細(xì)施經(jīng)Ｖｏｎ逡逑Ｋｏｓｓａ染色可見：在集落生長的細(xì)胞團(tuán)中央?yún)^(qū)，細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)掠黑色團(tuán)塊狀逡逑x鎪嵫緯戀�，技凅化綅（哇E保辭傘６哉兆椋鄭錚鑠澹耍錚螅螅崛舊跣浴ｅ義希擔(dān)

本文編號：2537703