【摘要】：Penaeidin-2是來(lái)源于南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)的一種重要的抗菌肽,兼具抗細(xì)菌和抗真菌活性。重組表達(dá)的Penaeidin與天然的Penaeidin具有非常相似的生物學(xué)活性。最新的研究表明,一些陽(yáng)離子抗菌肽具有抗腫瘤活性,但是同樣作為陽(yáng)離子抗菌肽,并未有研究關(guān)于rPen-2抗腫瘤作用的報(bào)道。 腎細(xì)胞癌(RCC)起源于腎小管或集合管上皮細(xì)胞,是成人最常見(jiàn)的腎部腫瘤,在成人腫瘤病例中占到了3%。腎細(xì)胞癌對(duì)化療和放療均具有抗性,選擇和發(fā)展新的腎細(xì)胞癌治療方式和藥物顯得非常必要。 在本研究中,我們?cè)u(píng)估了重組抗菌肽Penaeidin-2(rPen-2)選擇性殺滅腎癌細(xì)胞株ACHN和A498的效果和作用機(jī)制。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法顯示相對(duì)于正常腎細(xì)胞株HK-2, rPen-2對(duì)腎癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性和抑制生長(zhǎng)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)rPen-2濃度為100μg/mL時(shí)rPen-2對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有最大的抑制作用,此作用表現(xiàn)為劑量依賴性。同時(shí)rPen-2的抑制作用隨著作用時(shí)間而增強(qiáng),使用100μg/mL rPen-2處理細(xì)胞48小時(shí)后,ACHN和A498的最大抑制率分別為62.4%和70.4%,而此時(shí)HK-2細(xì)胞株的抑制率僅為13.2%。 DNA特異性染色和流式細(xì)胞分析顯示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了高比例的凋亡。Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞在經(jīng)過(guò)100μg/mL rPen-2處理24h后,相對(duì)于正常細(xì)胞HK-2,腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了更多的凋亡。AO/EB雙染用于區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡以及壞死,在腫瘤細(xì)胞中可以觀察到這些特征,同時(shí)一些細(xì)胞的細(xì)胞膜似乎也出現(xiàn)了損傷。為了更進(jìn)一步證明細(xì)胞的凋亡,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析并得到了相似的結(jié)果。流式細(xì)胞分析顯示,在用rPen-2處理24-48小時(shí)后,HK-2, ACHN和A498的死亡率分別為6.2-15.8%,28-62.9%,和41.7-71.5%,其中早期凋亡的比例分別為6.7-12.0%,22.7-33.7%和25.3-38%,晚期凋亡的比例分別為0.4-3.2%,1.7-32.5%和3.1-36.2%。乳酸脫氫酶(LDH)漏出實(shí)驗(yàn)表明,使用100μg/mL rPen-2處理24-48小時(shí)后的HK-2, ACHN和A498細(xì)胞的LDH漏出率分別為3.4%-5.3%,25.6%-32.3%,33.8%-35.3%,這些結(jié)果說(shuō)明rPen-2對(duì)腎癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用,而殺傷的模式包括凋亡和直接裂解細(xì)胞。 激光共聚焦顯微鏡以觀測(cè)rPen-2和細(xì)胞作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程。激光共聚焦顯微鏡顯示rPen-2在作用1小時(shí)后開(kāi)始結(jié)合到HK-2的細(xì)胞膜,但是在整個(gè)作用過(guò)程中,這種結(jié)合非常的微弱,然而,在腫瘤細(xì)胞中,大量的rPen-2結(jié)合到細(xì)胞膜并且迅速的進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)部。結(jié)果表明細(xì)胞膜是rPen-2和腫瘤細(xì)胞相結(jié)合并殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn),但是rPen-2進(jìn)入并定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核說(shuō)明rPen-2對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷尚有一些其他的機(jī)制。掃描電鏡(SEM)顯示了由rPen-2處理后腫瘤細(xì)胞膜的形態(tài)學(xué)變化。經(jīng)rPen-2作用的正常細(xì)胞呈現(xiàn)出光滑的膜表面,而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜則表現(xiàn)出現(xiàn)了褶皺,穿孔等形態(tài)學(xué)改變。 本研究首次對(duì)重組對(duì)蝦抗菌肽Penaeidin-2的腎癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)重組對(duì)蝦抗菌肽Penaeidin-2對(duì)腎癌細(xì)胞有選擇性殺傷作用,而對(duì)正常腎小管上皮細(xì)胞影響非常小。由于抗菌肽主要作用于細(xì)胞膜的殺傷腫瘤方式,能夠有效避免腎癌細(xì)胞的藥物抗性,這為開(kāi)發(fā)治療腎細(xì)胞癌新藥方面提供了一種可行的新思路。 抗菌肽(AMPs)是生物進(jìn)化過(guò)程中形成的先天防御系統(tǒng)的重要組成部分,廣泛的存在于各種生命形式中�？咕募婢呖垢锾m氏陽(yáng)性菌和抗革蘭氏陰性菌的能力,同時(shí)也具備抗真菌、抗原蟲(chóng)、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)活性。研究表明,抗菌肽主要通過(guò)攻擊細(xì)胞膜的方式來(lái)殺傷細(xì)菌和微生物,這種殺傷模式對(duì)抗性菌和敏感菌同樣有效。抗菌肽也有其他的殺傷模式,例如在進(jìn)入細(xì)胞后攻擊核染色體和核糖體等等�？咕牡纳飳W(xué)活性不僅僅是殺傷作用,在一些高等動(dòng)物體內(nèi),抗菌肽也扮演作為細(xì)胞的趨化性因子,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答等作用。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽主要作用于細(xì)胞膜,具有抗菌譜廣,殺傷速度快,能夠避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),也可與傳統(tǒng)抗生素合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),因此,抗菌肽是目前新型抗菌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。 淋病奈瑟菌是淋病的病原菌,淋病是在我國(guó)最主要的性傳播疾病之一,其發(fā)病率居我國(guó)性傳播疾病第二位。近年來(lái),隨著抗生素的廣泛使用,臨床上出現(xiàn)了多種淋病奈瑟菌耐藥株,對(duì)青霉素類,大環(huán)內(nèi)酯類,喹諾酮類等臨床常見(jiàn)抗生素普遍具有抗性,其中甚至有拮抗臨床上所有抗生素的超級(jí)抗菌株的出現(xiàn),已經(jīng)極大的威脅到人類健康,因此,研發(fā)新型抗淋病奈瑟菌藥物勢(shì)在必行。 本研究使用了小菜蛾抗菌肽pxCECA1,這種由本實(shí)驗(yàn)室分離得到的陽(yáng)離子抗菌肽具有表達(dá)量大,易于純化,生物學(xué)活性較高等特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明,小菜蛾抗菌肽pxCECA1對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌都具有抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)中,pxCECA1對(duì)大腸桿菌和青霉素抗性的大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)均為2μg/mL,表現(xiàn)出比融合表達(dá)的抗菌肽更好的抑菌活性。我們使用小菜蛾抗菌肽pxCECA1作用于無(wú)抗性淋病奈瑟菌和多重耐藥性淋病奈瑟菌,其MIC值均為4μg/mL,在較小的藥物濃度內(nèi)取得了較好的抗菌效果；生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)表明,pxCECA1對(duì)淋病奈瑟菌的抗菌能力呈劑量依賴關(guān)系,pxCECA1的抗菌能力體現(xiàn)為殺死細(xì)菌,而不僅僅是抑制細(xì)菌生長(zhǎng),而且這種直接殺傷作用在無(wú)抗性淋病奈瑟菌和多重耐藥性淋病奈瑟菌上并無(wú)明顯差別。與頭孢曲松鈉合用的協(xié)同抑菌實(shí)驗(yàn)表明,pxCECA1能夠和頭孢曲松鈉產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用,pxCECA1和頭孢曲松鈉的使用劑量都可以大大降低,不僅僅可以減少藥物使用劑量,也可以防止耐藥性的產(chǎn)生。這為臨床上開(kāi)發(fā)對(duì)淋病奈瑟菌多重抗性株治療藥物方面提供了實(shí)際可行的方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2411376