【摘要】：Penaeidin-2是來源于南美白對蝦(Penaeus vannamei)的一種重要的抗菌肽,兼具抗細(xì)菌和抗真菌活性。重組表達(dá)的Penaeidin與天然的Penaeidin具有非常相似的生物學(xué)活性。最新的研究表明,一些陽離子抗菌肽具有抗腫瘤活性,但是同樣作為陽離子抗菌肽,并未有研究關(guān)于rPen-2抗腫瘤作用的報(bào)道。 腎細(xì)胞癌(RCC)起源于腎小管或集合管上皮細(xì)胞,是成人最常見的腎部腫瘤,在成人腫瘤病例中占到了3%。腎細(xì)胞癌對化療和放療均具有抗性,選擇和發(fā)展新的腎細(xì)胞癌治療方式和藥物顯得非常必要。 在本研究中,我們評估了重組抗菌肽Penaeidin-2(rPen-2)選擇性殺滅腎癌細(xì)胞株ACHN和A498的效果和作用機(jī)制。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法顯示相對于正常腎細(xì)胞株HK-2, rPen-2對腎癌細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性和抑制生長活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)rPen-2濃度為100μg/mL時(shí)rPen-2對腫瘤細(xì)胞生長有最大的抑制作用,此作用表現(xiàn)為劑量依賴性。同時(shí)rPen-2的抑制作用隨著作用時(shí)間而增強(qiáng),使用100μg/mL rPen-2處理細(xì)胞48小時(shí)后,ACHN和A498的最大抑制率分別為62.4%和70.4%,而此時(shí)HK-2細(xì)胞株的抑制率僅為13.2%。 DNA特異性染色和流式細(xì)胞分析顯示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了高比例的凋亡。Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞在經(jīng)過100μg/mL rPen-2處理24h后,相對于正常細(xì)胞HK-2,腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了更多的凋亡。AO/EB雙染用于區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡以及壞死,在腫瘤細(xì)胞中可以觀察到這些特征,同時(shí)一些細(xì)胞的細(xì)胞膜似乎也出現(xiàn)了損傷。為了更進(jìn)一步證明細(xì)胞的凋亡,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染對細(xì)胞進(jìn)行分析并得到了相似的結(jié)果。流式細(xì)胞分析顯示,在用rPen-2處理24-48小時(shí)后,HK-2, ACHN和A498的死亡率分別為6.2-15.8%,28-62.9%,和41.7-71.5%,其中早期凋亡的比例分別為6.7-12.0%,22.7-33.7%和25.3-38%,晚期凋亡的比例分別為0.4-3.2%,1.7-32.5%和3.1-36.2%。乳酸脫氫酶(LDH)漏出實(shí)驗(yàn)表明,使用100μg/mL rPen-2處理24-48小時(shí)后的HK-2, ACHN和A498細(xì)胞的LDH漏出率分別為3.4%-5.3%,25.6%-32.3%,33.8%-35.3%,這些結(jié)果說明rPen-2對腎癌細(xì)胞具有選擇性殺傷作用,而殺傷的模式包括凋亡和直接裂解細(xì)胞。 激光共聚焦顯微鏡以觀測rPen-2和細(xì)胞作用的動態(tài)過程。激光共聚焦顯微鏡顯示rPen-2在作用1小時(shí)后開始結(jié)合到HK-2的細(xì)胞膜,但是在整個(gè)作用過程中,這種結(jié)合非常的微弱,然而,在腫瘤細(xì)胞中,大量的rPen-2結(jié)合到細(xì)胞膜并且迅速的進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)部。結(jié)果表明細(xì)胞膜是rPen-2和腫瘤細(xì)胞相結(jié)合并殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn),但是rPen-2進(jìn)入并定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核說明rPen-2對腫瘤細(xì)胞的殺傷尚有一些其他的機(jī)制。掃描電鏡(SEM)顯示了由rPen-2處理后腫瘤細(xì)胞膜的形態(tài)學(xué)變化。經(jīng)rPen-2作用的正常細(xì)胞呈現(xiàn)出光滑的膜表面,而腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜則表現(xiàn)出現(xiàn)了褶皺,穿孔等形態(tài)學(xué)改變。 本研究首次對重組對蝦抗菌肽Penaeidin-2的腎癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)重組對蝦抗菌肽Penaeidin-2對腎癌細(xì)胞有選擇性殺傷作用,而對正常腎小管上皮細(xì)胞影響非常小。由于抗菌肽主要作用于細(xì)胞膜的殺傷腫瘤方式,能夠有效避免腎癌細(xì)胞的藥物抗性,這為開發(fā)治療腎細(xì)胞癌新藥方面提供了一種可行的新思路。 抗菌肽(AMPs)是生物進(jìn)化過程中形成的先天防御系統(tǒng)的重要組成部分,廣泛的存在于各種生命形式中�？咕募婢呖垢锾m氏陽性菌和抗革蘭氏陰性菌的能力,同時(shí)也具備抗真菌、抗原蟲、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)活性。研究表明,抗菌肽主要通過攻擊細(xì)胞膜的方式來殺傷細(xì)菌和微生物,這種殺傷模式對抗性菌和敏感菌同樣有效�？咕囊灿衅渌臍Ｊ�,例如在進(jìn)入細(xì)胞后攻擊核染色體和核糖體等等�？咕牡纳飳W(xué)活性不僅僅是殺傷作用,在一些高等動物體內(nèi),抗菌肽也扮演作為細(xì)胞的趨化性因子,參與機(jī)體的免疫應(yīng)答等作用。與傳統(tǒng)抗生素相比,抗菌肽主要作用于細(xì)胞膜,具有抗菌譜廣,殺傷速度快,能夠避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),也可與傳統(tǒng)抗生素合用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),因此,抗菌肽是目前新型抗菌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。 淋病奈瑟菌是淋病的病原菌,淋病是在我國最主要的性傳播疾病之一,其發(fā)病率居我國性傳播疾病第二位。近年來,隨著抗生素的廣泛使用,臨床上出現(xiàn)了多種淋病奈瑟菌耐藥株,對青霉素類,大環(huán)內(nèi)酯類,喹諾酮類等臨床常見抗生素普遍具有抗性,其中甚至有拮抗臨床上所有抗生素的超級抗菌株的出現(xiàn),已經(jīng)極大的威脅到人類健康,因此,研發(fā)新型抗淋病奈瑟菌藥物勢在必行。 本研究使用了小菜蛾抗菌肽pxCECA1,這種由本實(shí)驗(yàn)室分離得到的陽離子抗菌肽具有表達(dá)量大,易于純化,生物學(xué)活性較高等特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明,小菜蛾抗菌肽pxCECA1對大腸桿菌、綠膿桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌都具有抗菌活性。本實(shí)驗(yàn)中,pxCECA1對大腸桿菌和青霉素抗性的大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)均為2μg/mL,表現(xiàn)出比融合表達(dá)的抗菌肽更好的抑菌活性。我們使用小菜蛾抗菌肽pxCECA1作用于無抗性淋病奈瑟菌和多重耐藥性淋病奈瑟菌,其MIC值均為4μg/mL,在較小的藥物濃度內(nèi)取得了較好的抗菌效果；生長抑制實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)表明,pxCECA1對淋病奈瑟菌的抗菌能力呈劑量依賴關(guān)系,pxCECA1的抗菌能力體現(xiàn)為殺死細(xì)菌,而不僅僅是抑制細(xì)菌生長,而且這種直接殺傷作用在無抗性淋病奈瑟菌和多重耐藥性淋病奈瑟菌上并無明顯差別。與頭孢曲松鈉合用的協(xié)同抑菌實(shí)驗(yàn)表明,pxCECA1能夠和頭孢曲松鈉產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用,pxCECA1和頭孢曲松鈉的使用劑量都可以大大降低,不僅僅可以減少藥物使用劑量,也可以防止耐藥性的產(chǎn)生。這為臨床上開發(fā)對淋病奈瑟菌多重抗性株治療藥物方面提供了實(shí)際可行的方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2411376