【摘要】：第一部分：臍帶間充質干細胞增強無精子癥小鼠睪丸特異性基因表達 目的 在生殖男科領域,探索人臍帶間充質干細胞(HUCMSCs)對無精子癥的治療作用,通過移植HUCMSCs進入無精子癥小鼠模型,檢測生殖細胞特異性基因的表達,證實生殖細胞特異性基因的表達上調,從而表明HUCMSCs對睪丸生精功能的恢復可能具有促進作用。由此探索一條治療無精子癥的新途徑。 方法 1、無精子癥小鼠模型的建立 雄性8周齡BALB/C小鼠80只,采用腹腔內單次注射白消安35mg/kg。注射白消安后的第5周,切取5只小鼠的睪丸,HE染色后,觀察睪丸的生精上皮結構變化,確定模型的構建情況。剩余存活小鼠用于細胞移植實驗。 2.HUCMSCs的原代培養(yǎng)及鑒定 在獲得知情同意書的前提下,取不同個體來源的臍帶組織分別處理,PBS洗滌,獲得華通氏膠,采用組織塊法,將組織剪碎成1mm3大小,并貼于培養(yǎng)瓶內,根據干細胞本身的貼壁能力,將細胞培養(yǎng)在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。每3-4天換液。待細胞融合度達到80%,進行細胞傳代。收取培養(yǎng)的第三代HUCMSCs用于移植實驗。HEK293細胞作為對照組,同時進行正常培養(yǎng)。對生長良好的第三代]HUCMSCs進行鑒定,采用流式細胞術,分別檢鋇FITC-CD73, PE-CD105,ACP-CD31等表面抗原標志物的表達。通過G顯帶技術對第三代HUCMSCs進行核型分析。對第三代HUCMSCs分別進行成骨和成脂肪誘導分化,誘導21天后,分別使用茜素紅和油紅O,對誘導分化后的細胞進行染色。 3.HUCMSCs移植進入無精子癥小鼠模型睪丸 取第三代HUCMSCs用于移植實驗。注射濃度為1×107cell ml-1。取40只構建成功的無精子癥模型小鼠,隨機分為4組,每組10只：第一組不注射作為空白對照組；第二組注射生理鹽水作為陰性對照組；第三組注射HEK293細胞；第四組注射HUCMSCs。注射部位均為左側睪丸,右側睪丸不作處理設為對照。每次注射劑量為10μl。 4、睪丸特異性基因表達的檢測 分組移植后第三周,于每組各取5只小鼠,取雙側睪丸組織,分別提取RNA,逆轉錄之后,對生殖細胞特異性的、減數分裂相關的10個基因進行PCR擴增。基因分別是vasa, Scp3, Cyclin A1, Dazl, Stra8, miwi, Tnp2, Pgk2, Akap3, Tex18。β-actin基因作為內參同時被檢測。對每只小鼠的兩側睪丸進行比較。實驗結果統(tǒng)計分析采用mean±D, p≤0.05表示有顯著差異。 同時,于各組另取5只小鼠,取兩側睪丸組織,分別提取總蛋白。Western Blot檢測生殖細胞特異性的vasa, miwi, Scp3蛋白的表達。β-actin作為內參同時被檢測。對兩側睪丸進行比較后,實驗結果采用mean±SD進行統(tǒng)計分析,p≤0.05表示有顯著差異。 結果 1、無精子癥模型建立：注射35mg/ml白消安5周之后,對睪丸組織進行HE切片分析。結果顯示,曲細精管的管壁變薄,大量生殖細胞,包括精母細胞、精子細胞、以及成熟精子都被去除,僅保留少量精原細胞以及支持細胞。睪丸顯示為無精子狀態(tài)。 2、HUCMSCs的培養(yǎng)以及鑒定：使用組織塊法對HUCMSCs進行原代培養(yǎng)并傳代。對第三代HUCMSCs進行鑒定。流式細胞術檢測結果顯示,HUCMSCs能夠表達CD73, CD105等間充質干細胞表面抗原標志物,不表達CD31造血系細胞表面標志物；G顯帶分析結果顯示HUCMSCs核型正常；HUCMSCs經成骨和成脂肪誘導分化21天之后,茜素紅和油紅O分別染色均呈現陽性。 3、HUCMSCs移植進入無精子癥小鼠模型睪丸：分組注射左側睪丸后,分籠正常飼養(yǎng)小鼠3周,期間小鼠狀態(tài)良好,沒有出現死亡。 4、移植3周之后,注射了HUCMSCs小鼠的睪丸中,生殖細胞特異性基因的表達明顯高于對側未注射HUCMSCs的睪丸組織；而注射了生理鹽水和HEK293細胞的睪丸,較對側相比,生殖細胞特異性基因的表達沒有明顯變化。對各組的比較分析結果顯示,注射了HUCMSCs之后的小鼠睪丸,生殖細胞特異性基因的表達水平明顯高于注射了生理鹽水和HEK293細胞的睪丸組織。在檢測vasa, miwi, Scp3等生殖細胞特異性蛋白的表達時,注射了HUCMSCs的睪丸組,明顯高于注射了生理鹽水和HEK293細胞組。 結論 1、采用適當劑量的化療藥物白消安,在保證動物存活率的情況下,可以成功誘導小鼠無精子癥模型。從而保證了其作為受體進行干細胞的移植實驗。 2、經組織塊法原代培養(yǎng)的HUCMSCs,減輕了消化酶對細胞可能造成的不利影響。采用低代次的HUCMSCs進行移植,細胞幾乎不存在免疫原性。對HUCMSCs細胞特性的檢測,方法簡便有效。 3、確定HUCMSCs對生殖細胞特異性基因的表達具有促進作用。通過與注射生理鹽水和HEK293細胞的睪丸對照組進行比較,說明促進作用不是由注射過程或導入異源細胞本身所引起。 4、探索干細胞治療無精子癥的可能性。并為干細胞治療成為輔助生殖技術的補充,應用于治療無精子癥提供了實驗依據。 第二部分精子發(fā)生中GRTH蛋白結合基序與TP2mRNA作用區(qū)域的研究 目的 促性腺激素調節(jié)睪丸RNA解旋酶(GRTH/DDX25),是一個睪丸特異性的蛋白,屬于RNA解旋酶中的DEAD box家族,高表達于減數分裂粗線期、中期精母細胞和圓形精子細胞中。這個蛋白受發(fā)育調節(jié)的控制,并主要在轉錄后水平對精子發(fā)生進行調節(jié)。為了理解GRTH t何在轉錄后水平對過渡蛋白2(TP2)進行調節(jié),本研究重點闡明GRTH蛋白與生殖細胞特異性TP2mRNA轉錄物結合的作用區(qū)域。通過鑒定GRTH的RNA結合基序以及TP2生殖細胞轉錄物的結合位點,明確3'UTR順式作用元件的作用區(qū)域,進而深化GRTH在生殖細胞發(fā)育過程中對TP2轉錄本的調節(jié)機制的認識。這一研究對于進一步理解雄性生殖功能具有重要意義。 方法 1、GRTH全長、截短序列以及TP23'UTR重組質粒的構建 使用小鼠睪丸組織的cDNA為模板,PCR擴增GRTH全長片段(NM_013932.4)和TP23'UTR區(qū)域片段(TP2, NM_013694, nt408-535)。將GRTH全長片段插入帶有Hind3和Xbal位點的pcDNA3.1(+)載體,構建GRTH全長重組質粒。根據GRTH截短片段的設計,分別進行擴增并連接到pcDNA3.1(+)載體,標記為：pcDNA3.1-483(a.a1-483), pcDNA3.1-G423(a.a1-423), pcDNA3.1-G115-483(a.a116-483), pcDNA3.1-G138(a.a1-138), pcDNA3.1-G166(a.a1-166), pcDNA3.1-G244(a.a1-244), pcDNA3.1-G325(a.a1-325), pcDNA3.1-G388(a.a1-388)。將TP23'UTR片段插入帶有Hind3和EcoRl位點的pST18載體。構建TP23'UTR重組質粒。 2. GRTH全長(G483)突變重組質粒的構建 使用QuickChange mutagenesis kit將G483的第V結構域由ARGID突變?yōu)锳AAID,記為G483Vx將第Ia結構域由PTYELA突變?yōu)镻TSALA,記為G483Iax;隨后使用G483Vx質粒為模板,突變其第Ia結構域,記為G483IaxVx。測序驗證。 3、體外轉錄和翻譯系統(tǒng)表達GRTH全長、截短片段蛋白以及Western blot檢測將1μg GRTH全長、截短片段以及突變重組質粒,使用TNT兔網織紅細胞蛋白提取物系統(tǒng),300C孵育90min。Western blot檢測蛋白表達。 4、生物素末端標記TP23'UTR以及分段合成TP23'UTR的RNA 線性化pST18-TP2-3' UTR質粒,使用T7RNA polymerase體外轉錄系統(tǒng)合成TP23'UTR的RNA；使用T4RNA ligase將RNA與生物素進行連接,總共標記50pmol的RNA,隨后采用dotting實驗檢測標記效率。將127nt長度的TP23'UTR分為3段,每2段之間有10nt的重疊區(qū)間,每段大約50nt,分別標記為T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)。同時合成生物素標記的探針和非標記的探針,后者用于競爭性結合。 5、RNA凝膠電泳遷移實驗檢測GRTH各蛋白與TP23'UTR片段的相互作用 每個反應都是使用20fmol生物素標記的RNA探針與4pmol蛋白共同孵育。安排如下：首先進行GRTH全長蛋白(G483)與TP23'UTR RNA的結合實驗；隨后分別進行G483、G115/483.、G423、G388、G325、G244、G166、G138與T1(381/430)、T2(421/470)、T3(461/510)的結合實驗；在超泳動實驗中,加入anti-V5抗體,分別檢測G483、G115/483、G423、G388、G325、G244與T1(381/430)、T3(461/510)的相互作用；使用GRTH的突變重組質粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx的表達蛋白與T1(381/430)探針進行結合實驗。所有結合反應均使用Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit進行檢測。 結果 1、RNA-EMSA分析GRTH和127nt TP23'UTR轉錄物的相互作用。為了明確GRTH蛋白與TP23'UTR轉錄物結合的特異性結合基序,首先根據RNA解旋酶蛋白的普遍存在的保守基序,設計了GRTH截短片段的序列。每一個GRTH截短片段的C端都有V5標簽標記。Western blot結果顯示,由體外轉錄和翻譯系統(tǒng)表達的GRTH的各個截短片段與預期一致。當使用GRTH全長片段(G483)蛋白與TP23'UTR轉錄物相互作用時,首先構建TP23'UTR的克隆并轉錄為RNA,并在其末端標記生物素。RNA-EMSA顯示,G483可以和TP23'UTR轉錄物相結合,當加入競爭性探針時,能夠阻滯標記了生物素的TP23'UTR探針結合。 2、RNA EMSA分析GRTH截短片段蛋白與TP23'UTR分段探針的結合。為了進一步明確TP23'UTR區(qū)域順式作用元件與GRTH蛋白的相互作用,我們設計了3個連續(xù)的、有重疊序列區(qū)間(10nt)的寡核苷酸探針。同時為了系統(tǒng)分析GRTH與TP2轉錄物結合基序的結合屬性,采用DDX19的晶體結構模型作為參照。結果所示,G483蛋白可以和T1探針(48nt)形成蛋白-RNA復合體,T1探針位于緊接TGA終止密碼子的區(qū)域,同時可見GRTH與T3(78-127nt)探針也形成了復合體。這個結果同樣出現在G423蛋白與TP23'UTR轉錄物的結合實驗中。G388與TP23'UTR T1探針作用時,實驗中并沒有出現特異性結合的條帶。G423中包含Motif V,而G388中不含Motif V。說明Motif V在T1與GRTH的結合中可能起到了關鍵作用。T2探針不能與GRTH全長以及各截短片段蛋白相互作用,說明介于T1和T3之間的序列區(qū)域不能發(fā)揮順式作用元件的功能與GRTH結合。 3、G325是缺失了domain II序列的蛋白,domain II包含motifs IV, Vand VⅥ。G325可以和T1探針結合,有兩條帶出現。而T1在與G244的結合中,只能檢測到一條帶。在G325和G244結合實驗中,兩者都不能和T2、T3結合。這表明在GRTH的domain I區(qū)域存在另一個RNA結合位點。G166、G138兩個蛋白都是缺失了Ia結構域序列的蛋白,而Ia結構域在RNA解旋酶中被認為是RNA結合位點,實驗證實G166、G138不能與TP23'UTR轉錄物的所有片段結合。這說明了Ia結構域對于GRTH結合于RNA轉錄物的重要性。 4、G115/483是去掉N端114個氨基酸序列的GRTH蛋白,其與TP23'UTR轉錄物的結合特征相似于G483：能夠與T1、T3探針結合。此結果與G138的結合特征具有一致性,說明GRTH蛋白N端1146個氨基酸對RNA結合沒有貢獻。G115/483與T3探針的結合反而增強。 5、Supershift實驗分析GRTH-TP23'UTR RNA的結合。在加入anti-V5抗體之后,(G483, G115/483, G423, G325與T1探針結合的復合體都出現了超泳動。同樣發(fā)生與T3探針的結合實驗中。 6、EMSA分析GRTH突變重組蛋白與TP23'UTR的結合。GRTH的突變重組質粒G483Iax、G483Vx、G483Iax/Vx蛋白與T1(381/430)探針分別作用。結果顯示,單獨突變GRTH的一個RNA結合點時,結合反應仍然發(fā)生,但是當同時突變2個RNA結合位點時,不出現結合反應。說明GRTH在與TP23'UTR的結合過程中,2個RNA結合位點很可能是協(xié)同發(fā)揮作用。 結論 1、證實了GRTH蛋白的RNA結合結構域可以和TP23'UTR的RNA相互作用。這一結果和理論上RNA解旋酶中的Ia結構域、V結構域具有RNA結合功能相吻合。同時證明2個RNA結合位點很可能是協(xié)同發(fā)揮作用。 2、研究證實,緊接TP2終止密碼子的3'UTR區(qū)域的50bp序列(T1區(qū)間),相對于其它區(qū)域,對于與GRTH的結合具有更重要的作用。 3、本研究所證實GRTH蛋白與TP2RNA形成特異性的RNA結合復合體,進一步明確了GRTH作為mRNP的組成,參與了TP2RNA信息從細胞核向細胞質的運送。 4、通過對GRTH蛋白中的保守RNA結合基序的研究,深化了對TP2在轉錄后水平的表達調控的理解,進一步認識了多核糖體位點的相關組成部分。 5、GRTH (DDX25)蛋白與其同系物DDX19蛋白晶體結構的相似性很高。從而說明了RNA結合結構域(Ia和V)結合并調節(jié)相關RNA的普遍性。通過對GRTH在基因表達調控中作用的研究,進一步認識了GRTH在生殖細胞伸長和完成精子發(fā)生中所起到的重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R698.2

【共引文獻】

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本文編號：2410741