【摘要】：目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種慢性代謝性疾病,主要特征包括高血糖、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和胰腺β細胞分泌胰島素障礙等。世界上的糖尿病患者人數(shù)已經(jīng)超過3.47億。其中,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢,發(fā)病人數(shù)約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%。糖尿病可以導致一系列的微小血管和大血管并發(fā)癥,例如:糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變、缺血性心臟病和腦血管病等。因此,研制安全、有效的糖尿病治療藥物具有十分重要的意義。其中,分子水平靶向藥物具有非常好的前景。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病較為常見的微血管并發(fā)癥之一,也是導致患者出現(xiàn)終末期腎臟疾病的首要原因。三分之一的1型和2型糖尿病患者會發(fā)生糖尿病腎病。我國2型糖尿病患者的糖尿病腎病發(fā)病率約為6.6%至18.51%,且呈明顯上升趨勢。但是,目前尚無治療糖尿病腎病的有效方法。研究發(fā)現(xiàn),腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells,RTEC)損傷是比腎小球損傷更能反映腎臟功能不全的指標。腎臟近曲小管上皮細胞損傷在糖尿病腎病患者、小鼠糖尿病模型和大鼠糖尿病模型的病理切片中普遍存在,這提示腎臟近曲小管上皮細胞損傷是腎小管損傷的重要組成部分,也是衡量疾病進展情況的可靠指標。此外,血糖升高可以導致近曲小管上皮損傷,而后者隨后會導致嚴重的腎臟功能異常。但是,近曲小管上皮細胞損傷過程中的具體機制尚未完全闡明。c-Src是Src酪氨酸激酶家族中的重要成員,在有絲分裂、細胞生長和腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮了重要作用。c-Src受到高糖等外界刺激后發(fā)生磷酸化并被激活,隨后使許多細胞膜蛋白、胞漿蛋白和核蛋白發(fā)生磷酸化并傳遞細胞內(nèi)信號。值得關(guān)注的是,c-Src可能與2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病密切相關(guān)。研究表明,c-Src活性在糖尿病動物腎臟以及高糖條件培養(yǎng)下的腎小球系膜細胞和足細胞中都明顯升高。因此,c-Src已經(jīng)被公認為糖尿病腎病的重要調(diào)節(jié)因子。但是,c-Src及其下游信號通路在腎小管上皮細胞損傷以及糖尿病腎病發(fā)病機制中的作用尚不明確。本研究中,我們將探討c-src信號通路在腎臟損傷中作用。在體內(nèi),利用c-src特異性抑制劑pp2,觀察c-src信號通路對腎臟功能、細胞凋亡的影響;在體外,觀察c-src及其下游信號分子p38mapk、egfr在高糖培養(yǎng)條件下腎小管上皮細胞凋亡中的作用和分子機制。本研究將為糖尿病腎病防治提供新的作用靶點和思路,具有重要的理論意義和實用價值。方法:1c-src信號通路在db/db糖尿病小鼠腎臟損傷中的作用從南京大學模式動物研究所(modelanimalresearchcenterofnanjinguniversity)購買雄性bks背景的db/db糖尿病小鼠和db/m對照小鼠。參照美國國立衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth,nih)動物飼養(yǎng)指南,將小鼠飼養(yǎng)于無特定病原體(specific-pathogen-free,spf)級實驗動物房,每日更換墊料、水和食物。經(jīng)過適應(yīng)性飼養(yǎng)后,于第8周齡開始實驗。飼養(yǎng)過程符合河北醫(yī)科大學倫理委員會的要求。將小鼠隨機分組如下:(1)正常對照組(controlgroup):db/m小鼠10只,正常飼養(yǎng),不進行實驗藥物干預;(2)糖尿病組(diabetesgroup):db/db小鼠10只,正常飼養(yǎng),不進行實驗藥物干預;(3)糖尿病治療組(pp2group):db/db小鼠10只,正常飼養(yǎng)的同時,給予c-src特異性抑制劑pp2藥物干預。給藥方法如下:將c-src抑制劑pp2溶于dmso,按照2mg/kg的標準,將藥物經(jīng)腹腔注射入小鼠體內(nèi)(給藥前反復吹打、混勻)。作為對照,正常對照組(controlgroup)和糖尿病組(diabetesgroup)給予腹腔注射等量生理鹽水。第16周齡,將小鼠置于代謝籠中收集24h尿液�？崭�6h后,稱量體重,經(jīng)股動脈取血后分離血清、凍存?zhèn)溆?處死小鼠后,固定在蠟板上,切取、稱量腎臟后,取部分腎組織置于4%多聚甲醛,用于常規(guī)he染色和免疫組化檢測;取部分腎組織置于2.5%戊二醛固定液,用于電鏡觀察;取部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱,用于westernblotting檢測phospho-src、totalc-src、phospho-p38mapk、totalp38mapk、cleavedcaspase-3,bax,bcl-2和β-actin等蛋白質(zhì)表達情況。2c-src/p38mapk信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用人腎小管上皮細胞hk-2(humankidney-2)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(americantypeculturecollection,atcc)。用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)hk-2細胞,培養(yǎng)條件為5%co2、37℃。采用胰蛋白酶消化法傳代。隔日更換培養(yǎng)液1次。待hk-2細胞達70-80%匯合后,用無血清dmem培養(yǎng)液同步24h。將hk-2細胞分成7組:正常糖對照組(5.6mmol/lglucose,ng)、正常糖+高滲對照組(5.6mmol/lglucose+24.5mmol/lmannitol,m)、正常糖+pp2組(5.6mmol/lglucose+2μmol/lpp2,ng+pp2)、正常糖+sb203580組(5.6mmol/lglucose+10μmol/lsb203580,ng+sb203580)、高糖組(30mmol/lglucose,hg)、高糖+pp2組(30mmol/lglucose+2μmol/lpp2,hg+pp2)和高糖+sb203580組(30mmol/lglucose+10μmol/lsb203580,hg+sb203580)。pp2和sb203580均在高糖刺激前2h開始給藥。收集細胞后提取全蛋白,用于westernblotting檢測phospho-src、totalc-src、phospho-p38mapk、totalp38mapk、pparγ、chop、cleavedcaspase-3、bax、bcl-2和β-actin等蛋白質(zhì)表達情況。利用細胞免疫熒光技術(shù)檢測hk-2細胞的c-src和p38mapk活性。此外,采用tunel技術(shù)和流式細胞術(shù)檢測hk-2細胞凋亡。3c-src/egfr信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用人腎小管上皮細胞hk-2(humankidney-2)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(americantypeculturecollection,atcc)。用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)hk-2細胞,培養(yǎng)條件為5%co2、37℃。采用胰蛋白酶消化法傳代。隔日更換培養(yǎng)液1次。待hk-2細胞達70-80%匯合后,用無血清dmem培養(yǎng)液同步24h。將hk-2細胞分成4組:將細胞分成4組:對照組(5.6mmol/ld-葡萄糖,ng)、滲透壓對照組(5.6mmol/ld-葡萄糖+24.5mmol/l甘露醇,m)、高糖組(30mmol/ld-葡萄糖,hg)和高糖+抑制劑組(30mmol/ld-葡萄糖+0.2mmol/lag1478,hg+ag1478)。于刺激48h后收集細胞。ag1478在高糖刺激前2h開始給藥。收集細胞后提取全蛋白,用于westernblotting檢測phospho-egfr、totalegfr、grp78、chop、cleavedcaspase-3、bax、bcl-2和β-actin等蛋白質(zhì)表達情況。采用流式細胞術(shù)檢測hk-2細胞凋亡情況。采用mtt檢測hk-2細胞活性變化。結(jié)果:1c-src信號通路在db/db糖尿病小鼠腎臟損傷中的作用(1)與正常對照組(controlgroup)相比,糖尿病組(diabetesgroup)的體重、攝食量、腎重和24h尿量明顯升高(p0.05或p0.01),但是腎重與體重比值略有降低(p0.01)。與糖尿病組(diabetesgroup)相比,糖尿病治療組(pp2group)的體重、攝食量略有升高(p0.01),腎重、腎重與體重的比值以及24h尿量明顯下降(p0.05或p0.01)。(2)與正常對照組(controlgroup)相比,糖尿病組(diabetesgroup)的血糖、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、低密度脂蛋白和24h尿白蛋白明顯升高(p0.01)。與糖尿病組(diabetesgroup)相比,糖尿病治療組(pp2group)的血糖、血清肌酐、尿素氮和24h尿白蛋白均明顯下降(p0.05或p0.01)。(3)免疫組織化學檢測結(jié)果顯示,正常對照組(controlgroup)中,phospho-src在腎小管和腎小球細胞胞漿中均有少量表達。糖尿病組(diabetesgroup)中,phospho-src在腎小管和腎小球細胞胞漿中的表達均有明顯增加。糖尿病治療組(pp2group)的上述表現(xiàn)有所減輕。(4)westernblotting檢測結(jié)果顯示,與正常對照組(controlgroup)相比,糖尿病組(diabetesgroup)腎組織phospho-src/totalc-src、phospho-p38mapk/totalp38mapk比值明顯增加(p0.05)。與糖尿病組(diabetesgroup)相比,糖尿病治療組(pp2group)的phospho-src/totalc-src、phospho-p38mapk/totalp38mapk比值明顯降低(p0.05或p0.01)。(5)westernblotting檢測結(jié)果顯示,與正常對照組(controlgroup)相比,糖尿病組(diabetesgroup)腎組織bax/bcl-2比值以及cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達明顯增加(p0.01)。與糖尿病組(diabetesgroup)相比,糖尿病治療組(pp2group)的bax/bcl-2比值以及cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達明顯減少(p0.01)。2c-src/p38mapk信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用(1)與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞導致c-src和p38mapk活性明顯升高,呈時間依賴性。其中,c-src活性在高糖刺激2h開始升高,12h表達最高,24h開始下降,但是仍高于正常糖對照組(p0.05或p0.01);p38mapk活性在高糖刺激12h開始升高,至少持續(xù)48h以上(p0.05或p0.01)。(2)westernblotting檢測結(jié)果顯示,與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)明顯升高(p0.01)。與hg組相比,pp2(hg+pp2組)能夠明顯降低phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)(p0.01)。免疫熒光檢測結(jié)果進一步驗證了上述結(jié)果。ng組、m組和ng+pp2之間的phospho-src/totalc-src和phospho-p38mapk/totalp38mapk比值(活性)無顯著差異。(3)westernblotting檢測結(jié)果顯示,與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的phospho-src/totalc-src比值(活性)明顯升高(p0.01)。與hg組相比,sb203580(hg+sb203580組)能夠明顯降低phospho-src/totalc-src比值(活性)(p0.05)。ng組、m組和ng+sb203580之間的phospho-src/totalc-src比值(活性)無顯著差異。此外,與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的pparγ、chop蛋白質(zhì)表達明顯升高(p0.05或p0.01)。與hg組相比,sb203580(hg+sb203580組)能夠明顯降低pparγ、chop蛋白質(zhì)表達(p0.05)。ng組、m組和ng+sb203580之間的pparγ、chop蛋白質(zhì)表達無顯著差異。(4)westernblotting檢測結(jié)果顯示,與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達明顯增加(p0.01)。與hg組相比,pp2(hg+pp2組)和sb203580(hg+sb203580組)均能夠明顯降低bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達(p0.01)。ng組、ng+pp2組和ng+sb203580組之間的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達無顯著差異。tunel染色和流式細胞術(shù)檢測進一步驗證了上述結(jié)果。(5)此外,westernblotting檢測結(jié)果還顯示,hg+pp2組、hg+sb203580組和hg+pp2+sb203580組之間的bax/bcl-2比值和cleavedcaspase-3蛋白質(zhì)表達無顯著差異。3c-src/egfr信號通路在腎小管上皮細胞凋亡中的作用(1)與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞導致egfr磷酸化水平(活性)明顯升高,呈時間依賴性:高糖刺激6h開始升高,至少持續(xù)48h以上(p0.01)。(2)與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明顯升高(p0.01)。與hg組相比,pp2(hg+pp2組)能夠明顯降低egfr磷酸化水平(活性)(p0.01)。ng組和m組之間的egfr磷酸化水平(活性)無顯著差異。(3)與ng組相比,高糖培養(yǎng)(hg組)hk-2細胞48h的egfr磷酸化水平(活性)明顯升高(p0.01)。與hg組相比,ag1478(hg+ag1478組)能夠明顯降低egfr磷酸化水平(活性)(p0.01)。ng組和m組之間的egfr磷酸化水平(活性)無顯著差異。(4)此外,我們檢測了ag1478對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標的影響。與NG組相比,高糖培養(yǎng)(HG組)HK-2細胞48 h的GRP78、CHOP蛋白質(zhì)表達明顯升高(P0.01)。與HG組相比,AG1478(HG+AG1478組)能夠明顯降低GRP78和CHOP蛋白質(zhì)表達(P0.05)。NG組和M組之間的GRP78、CHOP蛋白質(zhì)表達無顯著差異。(5)Western blotting檢測結(jié)果顯示,與NG組相比,高糖培養(yǎng)(HG組)HK-2細胞的Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白質(zhì)表達明顯增加(P0.01)。與HG組相比,AG1478(HG+AG1478組)能夠明顯降低Bax/Bcl-2比值和Cleaved caspase-3蛋白質(zhì)表達(P0.05或P0.01)。流式細胞術(shù)檢測進一步驗證了上述結(jié)果。(6)MTT檢測結(jié)果顯示,與NG組相比,高糖刺激HK-2細胞48 h后,HG組細胞活性顯著降低(P0.01)。與HG組相比,EGFR抑制劑AG1478明顯改善高糖對細胞活性的抑制作用(P0.05)。NG組和M組之間的細胞活性無顯著差異。結(jié)論:1體內(nèi)研究顯示,c-Src特異性抑制劑PP2能夠顯著改善db/db糖尿病小鼠的腎臟代謝指標,保護腎臟功能。PP2不僅能夠降低2型糖尿病小鼠腎臟的c-Src和p38 MAPK活性,還能夠減少腎臟細胞凋亡。2體外研究顯示,高糖培養(yǎng)HK-2細胞導致c-Src和p38 MAPK磷酸化水平(活性)明顯升高,呈時間依賴性。作為p38 MAPK的上游信號分子,抑制c-Src能夠降低高糖培養(yǎng)條件下細胞的p38 MAPK磷酸化水平(活性)。抑制p38 MAPK不僅能夠降低高糖培養(yǎng)條件下細胞的c-Src磷酸化水平(活性),還能夠減少PPARγ、CHOP蛋白質(zhì)表達。抑制c-Src/p38 MAPK信號通路能夠明顯減少HK-2細胞凋亡。3體外研究顯示,高糖培養(yǎng)HK-2細胞導致EGFR磷酸化水平(活性)明顯升高,呈時間依賴性。作為EGFR的上游信號分子,抑制c-Src能夠降低高糖培養(yǎng)條件下細胞的EGFR磷酸化水平(活性)。抑制EGFR能夠降低高糖培養(yǎng)條件下細胞的GRP78、CHOP蛋白質(zhì)表達。抑制c-Src/EGFR信號通路不僅能夠明顯減少HK-2細胞凋亡,還能改善細胞活性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9

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7 姜e，

本文編號：2403545