【摘要】：研究背景慢性腎病是腎損害或腎功能減退持續(xù)3個月以上,嚴(yán)重的導(dǎo)致尿毒癥的一組疾病。慢性腎病發(fā)病率高,致殘致死率高,治療費(fèi)用昂貴,嚴(yán)重影響人們的健康和生活,已成為當(dāng)前重要的“全球公共健康問題”。此病的早期通常是隱匿無癥狀的,常在診斷并發(fā)癥的時候被查出,早期慢性腎病是可逆的�？焖侔l(fā)展的腎病在數(shù)月之內(nèi)能導(dǎo)致腎衰,但是,大部分腎病都會潛伏數(shù)十年,甚至有些病人在后續(xù)的數(shù)年間病情不會惡化。所以在慢性腎病的早期作出診斷并進(jìn)行治療非常有必要。大量的研究證明,尿蛋白和腎病的發(fā)展是密切相關(guān)的。蛋白尿是普通人群腎病風(fēng)險和慢性腎病患者的標(biāo)志,也是導(dǎo)致腎病變的主要因素。研究發(fā)現(xiàn),大量白蛋白尿患者的腎病惡化和心血管疾病的死亡率比微量白蛋白尿或正常白蛋白尿患者高約6倍。尤其是大量白蛋白尿(即每天總蛋白的排泄量大于500 mg)總是與臨床上的尿蛋白和腎功能惡化相聯(lián)系。蛋白尿主要從以下幾個方面以病理角色參與腎功能的進(jìn)一步下降：1、血漿中各種成分,如補(bǔ)體、生長因子、炎性介質(zhì)的超濾和蛋白質(zhì)量和質(zhì)的改變,可加重白蛋白尿的腎毒性；2、大量的蛋白尿能引起體液潴留和高血壓,血脂異常和內(nèi)皮功能紊亂；3、足細(xì)胞上過多的蛋白負(fù)載,能釋放一種將腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)換生長因子β(TGF β),從而加劇腎小球細(xì)胞損傷；4、產(chǎn)生增多的尿蛋白,通過形成膜攻擊復(fù)合物與特殊受體結(jié)合,從而活化腎內(nèi)級聯(lián)補(bǔ)體,亦能促進(jìn)損傷發(fā)展。因此,如何減少或消除尿蛋白的漏出,是治療或修復(fù)腎病的關(guān)鍵。蛋白尿的發(fā)生與腎小球濾過膜功能異常密切相關(guān)。腎小球濾過屏障如有基因性或獲得性缺陷,都能導(dǎo)致腎小球濾過膜的損害、蛋白尿和腎病。在所有病理腎小球性蛋白尿中,都會出現(xiàn)大分子物質(zhì)(以白蛋白為主)不斷從屏障濾出。導(dǎo)致腎小球濾過膜功能異常的病因有很多：1、已被證明由透明質(zhì)酸酶和阿霉素破壞內(nèi)皮細(xì)胞的糖萼層后誘發(fā)了蛋白尿；2、腎小球基底膜固有的電荷層被破壞,帶有負(fù)電荷的白蛋白就容易漏出；3、在臨床上各種足細(xì)胞病表現(xiàn)為蛋白尿。目前對腎小球疾病的藥物治療存在不足,僅僅是延緩多數(shù)疾病的進(jìn)展,主要是控制全身的輔助因子,而不是根本病因或首要介導(dǎo)者。對腎小球病如糖尿病性腎病,最重要的治療是用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS),它們都有抗高血壓和抗蛋白尿作用；此外,免疫腎小球病,例如膜性腎病,是用免疫調(diào)節(jié)劑如糖皮質(zhì)激素,鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(如環(huán)孢霉素A)和細(xì)胞毒性藥物(如環(huán)磷酰胺)進(jìn)行治療,這些藥物是有效的,但有相當(dāng)大的副作用,而且病情容易反復(fù)。因此尋找治療慢性腎病的藥物無疑是當(dāng)前腎臟病衛(wèi)生戰(zhàn)略重點之一。一直以來,特別是近幾年,組裝(Self-assemble)因在創(chuàng)造新物質(zhì)、產(chǎn)生新功能和在醫(yī)學(xué)診斷和治療等領(lǐng)域的巨大潛力和優(yōu)勢而受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注和重視,是二十一世紀(jì)亟待解決的25個重大科學(xué)問題之一。組裝的概念最初源自生命科學(xué),是指單個生物分子通過弱鍵相互作用(范德華力、靜電力、疏水作用、π-π鍵、氫鍵和配位鍵)自發(fā)組織或集聚,形成有序結(jié)構(gòu)的過程,如蛋白質(zhì)的折疊聚集、生物膜的形成,甚至復(fù)雜生命有機(jī)體的形成。目前,生物分子納米組裝體已經(jīng)廣泛用于細(xì)胞、組織乃至生物體的治療和檢測。因此,如何通過生物組裝研制具有類似腎小球過濾膜性質(zhì)的生物膜是治療或修復(fù)腎功能迫切需要研究開發(fā)的課題。為使生物膜靶向到腎小球,需要尋找腎小球濾過膜上的特異蛋白。大量研究證明Nephrin是腎小球濾過膜上的特異蛋白。因此我們開展了如下研究：1、為防止大量蛋白濾出腎小球濾過屏障,我們將帶負(fù)電荷的聚合物組裝成不同形態(tài)、大小的納米粒子,再與Nephrin抗體組裝成抗體—聚合物復(fù)合物,簡稱為聚合物納米組裝體(PMb-anti-nephrin),使聚合物納米組裝體能特異靶向到腎小球,阻止蛋白通過,從而降低尿蛋白。2、用足細(xì)胞在體外探索聚合物納米組裝體(PMb-anti-nephrin)的毒性和對足細(xì)胞的特異靶向性。3、通過建立白蛋白腎病模型、嘌呤霉素氨基核苷腎病模型(PAN)和阿霉素腎病模型(ADR),驗證聚合物納米組裝體(PMb-anti-nephrin)對尿蛋白和足細(xì)胞病變的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行探討。第一部分聚合物薄膜(PMb-anti-nephrin)的組裝及其與nephrin抗體的偶聯(lián)研究目的本論文基于組裝的原理,將帶負(fù)電荷的聚合物組裝成孔徑和片狀大小適合的多孔薄膜。實驗方法1、制備聚合物,2、聚合物電荷性修飾,3、多孔薄膜自組裝,4、熒光素FITC的鏈接,5、多孔薄膜修飾抗-nephrin 。實驗結(jié)果通過組裝法成功地合成了負(fù)電性的多孔薄膜,且其大小和孔徑可調(diào)。多孔薄膜成功地接上了nephrin抗體,能特異性地靶向到腎小球濾過膜上。實驗小結(jié)制備得到的薄膜具有負(fù)電性和多孔性,能夠模擬腎小球濾過膜的功能,且其生物相容性好,為慢性腎病治療提供新思路。第二部分PMb-anti-nephrin對足細(xì)胞的特異靶向和對其活力的影響研究目的據(jù)研究,nephrin是腎臟特異性分子,僅表達(dá)于足細(xì)胞的基底面,而且主要聚集于足細(xì)胞指狀突起處。因此,本研究通過把nephrin的特異抗體鏈接在PMb聚合物納米組裝體上,觀察納米組裝體PMb-anti-nephrin對足細(xì)胞的特異靶向性和其對足細(xì)胞生長活力的影響。實驗方法小鼠永生化足細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),未分化的足細(xì)胞于33℃、10 U/m1的重組小鼠γ-干擾素的誘導(dǎo)下增生,為使足細(xì)胞分化,于37-C、無重組小鼠γ-干擾素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14 d,細(xì)胞貼壁生長,每2-3 d傳代一次。足細(xì)胞達(dá)70%～80%融合后換成無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)6h后進(jìn)行實驗。用CCK-8法測定細(xì)胞的活力,免疫熒光染色檢測納米組裝體PMb-anti-nephrin能否接合到足細(xì)胞上。實驗結(jié)果在一定的濃度范圍內(nèi),PMb-anti-nephrin對細(xì)胞活力無影響。CCK-8細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)高濃度(10mg/ml)的PMb-anti-nephrin對細(xì)胞有一定的毒性作用,但是,低濃度(0.1 mg/ml)的PMb-anti-nephrin對細(xì)胞無毒性作用。細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果顯示,先加入nephrin抗體占據(jù)表達(dá)在細(xì)胞膜的抗原結(jié)合位點,隨后加入的PMb-anti-nephrin未能結(jié)合到細(xì)胞上；未鏈接nephrin抗體的PMb也難以結(jié)合到細(xì)胞上；而直接加入的PMb-anti-nephrin能成功靶向到足細(xì)胞上。實驗小結(jié)1、高濃度的PMb-anti-nephrin對細(xì)胞有一定的毒性作用,但是,低濃度的PMb-anti-nephrin對細(xì)胞無毒性作用。這為后期在體內(nèi)實驗進(jìn)行干預(yù)提供了劑量范圍的參考。2、通過nephrin抗體,PMb-anti-nephrin能成功靶向到足細(xì)胞上。第三部分PMb-anti-nephrin對蛋白負(fù)荷、嘌呤霉素氨基核苷和阿霉素腎病鼠的蛋白尿和足細(xì)胞病變的影響研究目的通過建立大鼠蛋白負(fù)荷、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)和阿霉素(ADR)腎病模型,驗證PMb和PMb-anti-nephrin對蛋白尿和足細(xì)胞病變的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。實驗方法白蛋白腎病模型：雌性正常Wistar-Kyoto大鼠40只(初始體重100-150 g),購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心,分別進(jìn)行右腎全切術(shù)或假手術(shù)。1周后手術(shù)組給予BSA溶液腹腔注射,以5g/kg/d BSA腹腔注射,每周6d, BSA注射后第3天給與BSA+PMb組每只尾靜脈注射PMb 30 mg/kg,4天注射一次,BSA+PMb-anti-nephrin組每只尾靜脈注射PMb-anti-nephrin 30 mg/kg,4天注射一次,BSA+Saline組每只尾靜脈注射等體積的0.9%生理鹽水,4天注射一次。在注射BSA后的第32天處死大鼠。PAN腎病模型：雄性正常SD大鼠24只,用無菌生理鹽水將PA粉末配成20mg/ml溶液以150 mg/kg單次腹腔注射,PA注射后第3天隨機(jī)抽取16只PAN腎病大鼠,8只給與尾靜脈注射3 mg/kg PMb-anti-nephrin,另8只給與尾靜脈注射等量生理鹽水,在注射PA后的第10天處死大鼠。ADR腎病模型：雄性正常BABL/c小鼠24只,用無菌生理鹽水將AD粉末配成2 mg/ml溶液以10 mg/kg單次尾靜脈注射,AD注射后第3周隨機(jī)抽取16只AD腎病小鼠,8只給與尾靜脈注射30 mg/kg PMb-anti-nephrin,另8只給與尾靜脈注射等量生理鹽水,在注射PA后的第5周處死小鼠。實驗期間,收集24 h或12h尿液,用于尿蛋白定量,采用考馬斯亮藍(lán)-G 250法進(jìn)行檢測；定期眼球采血用于血肌酐的測定。刺激結(jié)束后,經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(35 mg/kg)后摘取心、肝、肺、腎等組織,HE和Masson染色觀察組織病理,免疫熒光染色檢測Podocin的蛋白表達(dá),透射電鏡染色觀察足細(xì)胞的病變。實驗結(jié)果由白蛋白模型腎病的24 h尿蛋白變化趨勢可見,PMb最高能使尿蛋白降低300mg(P0.05);而PMb-anti-nephrin最高能使尿蛋白降低500 mg(P0.05)。但兩者均不能使尿蛋白降至正常。而當(dāng)?shù)?5天到41天停止干預(yù)后,尿蛋白又開始上升。由PAN腎病的24 h尿蛋白變化趨勢可見,PMb-anti-nephrin能顯著降低尿蛋白(P0.05),但不能使尿蛋白降至正常。由ADR腎病的尿蛋白變化趨勢可見,在第3周給與PMb-anti-nephrin干預(yù)后,尿蛋白明顯下降,與同時期的ADR組相比,在第5周使尿蛋白降低將近一倍；升高的血肌酐則在干預(yù)兩周后明顯下降,同時下降的腎小球濾過率也明顯上升。從各重要臟器的病理染色可看出,PMb聚合物納米組裝體是安全無毒害的。從腎小球的光鏡染色也可看出,PMb和PMb-anti-nephrin能使腎間質(zhì)的炎癥細(xì)胞明顯減少,大量蛋白管型消失,腎小管細(xì)胞的形態(tài)有所恢復(fù)。由足細(xì)胞的標(biāo)記蛋白Podocin的免疫熒光可看出,給與PMb和PMb-anti-nephrin降低尿蛋白后,從沿腎小球毛細(xì)血管袢不連續(xù)細(xì)顆粒樣的分布轉(zhuǎn)變?yōu)榫�樣分布,說明表達(dá)下降的Podocin蛋白有了明顯升高(P0.05)；透射電鏡(TEM)的結(jié)果進(jìn)一步證實了這一點,蛋白尿腎病組腎小球足突不同程度變寬；足細(xì)胞高度腫脹,胞質(zhì)內(nèi)有明顯的空泡變性；足突彌漫性融合、消失,融合的足突內(nèi)可見微絲節(jié)段聚集形成斑塊樣結(jié)構(gòu)。給與PMb與PMb-anti-nephrin干預(yù)后這些病變明顯改善,鏡下僅見足突部分融合、變寬。實驗小結(jié)1、聚合物納米組裝體(PMb-anti-nephrin)能顯著降低尿蛋白。蛋白尿的治療效用歸因于多孔薄膜模擬了濾過膜和具有負(fù)電荷性。2、聚合物納米組裝體能顯著改善腎臟的病理變化和足細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

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本文編號：2395123