【摘要】：一、研究背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是世界最常見的泌尿系惡性腫瘤,在西方國家,前列腺癌在男性惡性腫瘤中高居首位。隨著目前我國老齡化加劇,醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步,環(huán)境的改變等因素,前列腺癌在我國呈現(xiàn)明顯上升的發(fā)病趨勢(shì)。前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)檢測(cè)自上世紀(jì)90年代應(yīng)用于臨床以來,明顯提高了前列腺癌的早期檢出率。但隨著PSA臨床檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用與研究,暴露出越來越多的檢測(cè)敏感性和特異性的問題,尤其在PSA 4~10ng/ml的灰區(qū)中,這類問題更加凸顯。發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志物,用以提高前列腺癌早期診斷率,成了當(dāng)前一個(gè)研究熱點(diǎn)。在人體中,超過50%的蛋白質(zhì)有糖基化修飾,這類蛋白也被稱之為糖蛋白。在許多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,相應(yīng)的糖蛋白會(huì)出現(xiàn)異常糖基化改變。PSA也是一種含糖基化修飾的糖蛋白,他在在Asn-69的N端有一個(gè)糖基化修飾位點(diǎn),目前已有研究表明在前列腺癌與非癌樣本的PSA中,N糖存在表達(dá)量的差異。但這些研究或僅局限于體外細(xì)胞系或局限于人體混合蛋白質(zhì)樣本或所取臨床樣本數(shù)較少。針對(duì)這些研究結(jié)果存在較大的爭議,其結(jié)論對(duì)于臨床診斷沒有很好的指導(dǎo)意義。為了更進(jìn)一步探討PSA的糖基化對(duì)于前列腺癌診斷的臨床意義,本課題收集了2015-2016年于上海長海醫(yī)院泌尿外科就診并發(fā)現(xiàn)前列腺異常改變或PSA升高(大于4ng/ml)的前列腺穿刺病人按摩后前列腺尿液,對(duì)于此類患者的PSA糖基化做一個(gè)深入研究。二、目的探討前列腺癌與非癌患者其PSA的糖基化特征,鑒定出PSA的主要N糖基結(jié)構(gòu),并且評(píng)估PSA糖基化在前列腺癌診斷中的臨床意義。三、方法(一)患者前列腺按摩后尿液樣本及患者信息采集。收集上海長海醫(yī)院2015-2016年間接受前列腺穿刺的401例樣本,隨機(jī)選取58例患者(29例前列腺癌、29例前列腺增生)按摩后尿液,以及患者相關(guān)的年齡、穿刺前血PSA、穿刺病理結(jié)果,Gleason評(píng)分等信息。根據(jù)患者術(shù)后穿刺病理將58例樣本分為前列腺癌組與對(duì)照組。(二)PSA分離純化、N糖酶切并標(biāo)記、UPLC-MS檢測(cè)分析利用免疫沉淀的方法純化尿液PSA蛋白,并進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE),切下相應(yīng)PSA目標(biāo)條帶。通過糖苷酶PNGase F膠內(nèi)酶解將N糖分子從純化的PSA上酶切釋放,萃取游離的N糖分子后用Rapi Fluor-MS標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記。以超高效液相色譜(UPLC)、配備熒光檢測(cè)(FLD)并串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間(QTOF)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PSA的N糖進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)分析。(三)N糖定性分析并以外切糖苷酶酶切試驗(yàn)驗(yàn)證鑒定結(jié)果將質(zhì)譜質(zhì)譜定性分析數(shù)據(jù)與NIBRT 3.2數(shù)據(jù)庫及Glyco Workbench 2.1數(shù)據(jù)庫匹配后,鑒定出PSA分子N糖類型。用α2-3,6,8,9神經(jīng)氨酸苷酶酶切已標(biāo)記的PSA N糖分子,酶切后再次進(jìn)行UPLC/FLD/ESI-QTOF-MS檢測(cè),對(duì)比酶切前后檢測(cè)結(jié)果以及數(shù)據(jù)庫糖型分析結(jié)果,初步驗(yàn)證了N糖型鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。(四)定量數(shù)據(jù)分析通過FLD色譜峰積分提取相應(yīng)的定量數(shù)據(jù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,尋找前列腺癌與非癌之間糖基化的差異。并評(píng)估不同的差異糖型對(duì)臨床診斷的意義。四、結(jié)果在本課題中,我們鑒定出了28種PSA上不同的N糖糖型,它們中絕大多數(shù)呈現(xiàn)雙天線復(fù)合結(jié)構(gòu)。并且發(fā)現(xiàn)PSA上不同糖型含量呈現(xiàn)三種主要的分布模式。從整體糖基分布模型上看,在前列腺癌患者與對(duì)照組中,PSA異常糖基化并沒有顯著差異。但N糖FA2以及FM5A2G2S1,在前列腺癌與非癌患者存在顯著的差異。在FA2、FM5A2G2S1及PSA的ROC曲線圖中,我們發(fā)現(xiàn)三者結(jié)合以后對(duì)于前列腺癌的預(yù)測(cè)能力比單獨(dú)前列腺癌的診斷效能有所提高。另一方面,從FA2在高危患者的分布表達(dá)量上看,它在Gleason評(píng)分大于等于8分的高級(jí)別前列腺癌患者中有明顯升高。五、結(jié)論P(yáng)SA蛋白N糖在前列腺癌患者與非癌組之間也存在一定差異。含有N糖FA2的PSA有望成為一種早期診斷高危前列腺癌的診斷標(biāo)志物。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wanqing Chen;;Cancer statistics: updated cancer burden in China[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

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本文編號(hào)：2393857