【摘要】：一、研究背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是世界最常見的泌尿系惡性腫瘤,在西方國家,前列腺癌在男性惡性腫瘤中高居首位。隨著目前我國老齡化加劇,醫(yī)療檢測技術(shù)的進步,環(huán)境的改變等因素,前列腺癌在我國呈現(xiàn)明顯上升的發(fā)病趨勢。前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)檢測自上世紀90年代應用于臨床以來,明顯提高了前列腺癌的早期檢出率。但隨著PSA臨床檢測技術(shù)的廣泛應用與研究,暴露出越來越多的檢測敏感性和特異性的問題,尤其在PSA 4~10ng/ml的灰區(qū)中,這類問題更加凸顯。發(fā)現(xiàn)一個新的標志物,用以提高前列腺癌早期診斷率,成了當前一個研究熱點。在人體中,超過50%的蛋白質(zhì)有糖基化修飾,這類蛋白也被稱之為糖蛋白。在許多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,相應的糖蛋白會出現(xiàn)異常糖基化改變。PSA也是一種含糖基化修飾的糖蛋白,他在在Asn-69的N端有一個糖基化修飾位點,目前已有研究表明在前列腺癌與非癌樣本的PSA中,N糖存在表達量的差異。但這些研究或僅局限于體外細胞系或局限于人體混合蛋白質(zhì)樣本或所取臨床樣本數(shù)較少。針對這些研究結(jié)果存在較大的爭議,其結(jié)論對于臨床診斷沒有很好的指導意義。為了更進一步探討PSA的糖基化對于前列腺癌診斷的臨床意義,本課題收集了2015-2016年于上海長海醫(yī)院泌尿外科就診并發(fā)現(xiàn)前列腺異常改變或PSA升高(大于4ng/ml)的前列腺穿刺病人按摩后前列腺尿液,對于此類患者的PSA糖基化做一個深入研究。二、目的探討前列腺癌與非癌患者其PSA的糖基化特征,鑒定出PSA的主要N糖基結(jié)構(gòu),并且評估PSA糖基化在前列腺癌診斷中的臨床意義。三、方法(一)患者前列腺按摩后尿液樣本及患者信息采集。收集上海長海醫(yī)院2015-2016年間接受前列腺穿刺的401例樣本,隨機選取58例患者(29例前列腺癌、29例前列腺增生)按摩后尿液,以及患者相關(guān)的年齡、穿刺前血PSA、穿刺病理結(jié)果,Gleason評分等信息。根據(jù)患者術(shù)后穿刺病理將58例樣本分為前列腺癌組與對照組。(二)PSA分離純化、N糖酶切并標記、UPLC-MS檢測分析利用免疫沉淀的方法純化尿液PSA蛋白,并進行聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE),切下相應PSA目標條帶。通過糖苷酶PNGase F膠內(nèi)酶解將N糖分子從純化的PSA上酶切釋放,萃取游離的N糖分子后用Rapi Fluor-MS標記試劑進行標記。以超高效液相色譜(UPLC)、配備熒光檢測(FLD)并串聯(lián)四級桿飛行時間(QTOF)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)對PSA的N糖進行液質(zhì)聯(lián)用檢測分析。(三)N糖定性分析并以外切糖苷酶酶切試驗驗證鑒定結(jié)果將質(zhì)譜質(zhì)譜定性分析數(shù)據(jù)與NIBRT 3.2數(shù)據(jù)庫及Glyco Workbench 2.1數(shù)據(jù)庫匹配后,鑒定出PSA分子N糖類型。用α2-3,6,8,9神經(jīng)氨酸苷酶酶切已標記的PSA N糖分子,酶切后再次進行UPLC/FLD/ESI-QTOF-MS檢測,對比酶切前后檢測結(jié)果以及數(shù)據(jù)庫糖型分析結(jié)果,初步驗證了N糖型鑒定結(jié)果的準確性。(四)定量數(shù)據(jù)分析通過FLD色譜峰積分提取相應的定量數(shù)據(jù)后進行統(tǒng)計學分析,尋找前列腺癌與非癌之間糖基化的差異。并評估不同的差異糖型對臨床診斷的意義。四、結(jié)果在本課題中,我們鑒定出了28種PSA上不同的N糖糖型,它們中絕大多數(shù)呈現(xiàn)雙天線復合結(jié)構(gòu)。并且發(fā)現(xiàn)PSA上不同糖型含量呈現(xiàn)三種主要的分布模式。從整體糖基分布模型上看,在前列腺癌患者與對照組中,PSA異常糖基化并沒有顯著差異。但N糖FA2以及FM5A2G2S1,在前列腺癌與非癌患者存在顯著的差異。在FA2、FM5A2G2S1及PSA的ROC曲線圖中,我們發(fā)現(xiàn)三者結(jié)合以后對于前列腺癌的預測能力比單獨前列腺癌的診斷效能有所提高。另一方面,從FA2在高�；颊叩姆植急磉_量上看,它在Gleason評分大于等于8分的高級別前列腺癌患者中有明顯升高。五、結(jié)論PSA蛋白N糖在前列腺癌患者與非癌組之間也存在一定差異。含有N糖FA2的PSA有望成為一種早期診斷高危前列腺癌的診斷標志物。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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1 Wanqing Chen;;Cancer statistics: updated cancer burden in China[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

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本文編號：2393857