【摘要】：第一部分：pGLV3/H1-shRNA干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株及pCDH-GFP-PCA3過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選與驗(yàn)證目的：PCA3基因在前列腺癌中高度特異性的表達(dá),預(yù)示著PCA3對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。目前,PCA3在前列腺癌中的功能及機(jī)制尚不清楚。為了探究其功能,我們通過(guò)構(gòu)建PCA3的干擾及過(guò)表達(dá)載體,并篩選出相應(yīng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,為后續(xù)的體外功能研究提供依據(jù)。方法：從Genbank中查找PCA3基因的序列號(hào)及其對(duì)應(yīng)序列,使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)PCA3分子的shRNA,分別構(gòu)建4對(duì)pGLV3/H1-sh2456, pGLV3/H1-sh2618, pGLV3/Hl-sh2702及pGLV3/H1-sh2913干擾載體及pGLV3/H1-control對(duì)照,以下調(diào)其在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)。將構(gòu)建好的干擾載體包裝成病毒后感染LNCaP細(xì)胞,經(jīng)real time PCR驗(yàn)證后篩選出干擾效率較高的細(xì)胞株；從PCA3高表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP中提取總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)三對(duì)引物,以cDNA為模板擴(kuò)增3個(gè)分片段,通過(guò)重疊延伸后連接成全長(zhǎng)構(gòu)成PCA3。將PCA3與pCDH-GFP質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,挑選克隆后并經(jīng)PCR、酶切進(jìn)行驗(yàn)證,送測(cè)序,。將構(gòu)建好的pCDH-GFP-PCA3表達(dá)質(zhì)粒包裝成病毒后感染前列腺癌細(xì)胞株DU145及PC3,流式分選并經(jīng)real time PCR驗(yàn)證后獲得分別過(guò)表達(dá)PCA3及含空載的穩(wěn)定細(xì)胞株。結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了干擾載體,而且real time PCR結(jié)果同時(shí)證實(shí)并建立了穩(wěn)定低表達(dá)PCA3的前列腺癌細(xì)胞株及穩(wěn)定高表達(dá)PCA3的前列腺癌細(xì)胞株。結(jié)論：PCA3干擾及過(guò)表達(dá)載體的成功構(gòu)建,為深入研究PCA3基因在前列腺細(xì)胞中的作用奠定了基礎(chǔ),進(jìn)而為探索前列腺癌治療的新途徑提供了可能。第二部分：研究PCA3干擾和過(guò)表達(dá)后對(duì)前列腺癌細(xì)胞功能的影響及機(jī)制的初步研究目的：研究PCA3干擾和過(guò)表達(dá)后在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、周期、遷移及侵襲的影響。方法：將第一部分篩選出的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,通過(guò)CCK-8法(PCA3過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn))和EdU法(PCA3干擾實(shí)驗(yàn))及細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期,transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移及侵襲能力。并將存在功能差異的干擾細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,探求兩組細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平分子的表達(dá)差異。結(jié)果：下調(diào)PCA3的表達(dá)后,LNCaP細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的增殖能力下降(P0.05),且遷移(P=0.0001)與侵襲(P0.0001)能力也顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在DU145及PC3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PCA3后,細(xì)胞在增殖、遷移及侵襲的生物學(xué)功能方面與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)PCA3分子后,實(shí)驗(yàn)組中與細(xì)胞粘附信號(hào)通路的基因表達(dá)有明顯的下降,而參與TGF-beta信號(hào)通路的基因表達(dá)明顯上升。結(jié)論：PCA3可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,下調(diào)PCA3后能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞株LNCaP的生長(zhǎng)及遷移侵襲能力,預(yù)示著PCA3可能是治療前列腺癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果提示,PCA3分子可能通過(guò)影響細(xì)胞粘附分子的表達(dá)及TGS-beta的表達(dá)水平來(lái)影響細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：2387744