發(fā)布時(shí)間：2018-12-15 09:54

【摘要】：腎臟纖維化作為慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的常見(jiàn)病理特征主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。腎臟纖維化的進(jìn)程可引起功能性腎實(shí)質(zhì)的持續(xù)性損失,最終導(dǎo)致終末期腎病。腎小管上皮細(xì)胞功能損傷是引起腎臟纖維化的眾多病因之一。II型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化理論認(rèn)為損傷的上皮細(xì)胞能夠成為肌纖維母細(xì)胞直接前體。盡管該理論存在一定爭(zhēng)議,但病理?xiàng)l件下,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)表達(dá)升高,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白合成增加等變化,確實(shí)能夠參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展進(jìn)程。許多蛋白、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子均參與了腎間質(zhì)纖維化的形成。越來(lái)越多的證據(jù)表明血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是腎素血管緊張素系統(tǒng)(rennin angiotensin system, RAS)中最重要的活性成分。在病理生理?xiàng)l件下,Ang Ⅱ水平升高能夠引起炎癥及纖維化反應(yīng)。Ang Ⅱ是包括梗阻性腎病等多種腎臟病情況下導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要病理媒介。多項(xiàng)研究證實(shí),抑制腎臟局部R,AS能夠減緩單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型誘導(dǎo)的促纖維化反應(yīng)。Janus激酶(Janus kinase, JAK)家族/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與多種細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子的表達(dá)調(diào)控過(guò)程。JAK2/STAT3也是Ang Ⅱ下游研究較多的信號(hào)通路之一。STAT3對(duì)促進(jìn)細(xì)胞周期及防止細(xì)胞凋亡具有十分重要的作用。近年來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)STAT3能夠介導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生,尤其是在梗阻性腎病中。目前已有研究報(bào)道Ang Ⅱ或STAT3參與了腎損傷的發(fā)生,但Ang Ⅱ/STAT3通路與腎臟纖維化的直接關(guān)系還尚不明確。STAT3的激活需705位酪氨酸t(yī)yrosine 705, Tyr705)及727位色氨酸(serine 727, Ser727)的磷酸化,而其685位賴(lài)氨酸(lysine 685, Lys685)能夠進(jìn)行可逆的乙�；TAT3這一氨基酸位點(diǎn)的乙�；艿浇M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合因子(cAMP response element binding protein-binding protein, CBP)/p300以及組蛋白去乙�；�(histone deacetylases, HDAC)的調(diào)控,并且與STAT3二聚體的形成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄激活輔因子p300及其同源的CBP能夠通過(guò)其底物和下游的輔激活因子如STAT3,調(diào)控多種細(xì)胞活動(dòng)。另外,有大量證據(jù)顯示p300能夠促進(jìn)纖粘連蛋白(fibronectin)的沉積,而fibronectin則是ECM標(biāo)志分子,與細(xì)胞粘附及纖維化密切相關(guān)。SIRT1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1)是研究較多的催化STAT3去乙�；腍DAC之一。SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotid, NAD+)依賴(lài)的III類(lèi)HDAC,煙酰胺(nicotinamide, NIC)能夠抑制其活性。具有腎臟保護(hù)作用的天然多酚白藜蘆醇(resveratrol)可激活SIRT1從而使STAT3 Lys685去乙酰化。Resveratrol的腎臟保護(hù)作用與Smad3, p53及NF-KB(p65)等通路有關(guān),然而抑制STAT3乙酰化是否與resveratrol的抗纖維化作用有關(guān)還有待證實(shí)。本研究觀(guān)察了STAT3乙酰化與磷酸化在AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)及UUO引起的腎臟纖維化中的相互關(guān)系,進(jìn)而從離體及整體上揭示STAT3信號(hào)通路在腎臟纖維化發(fā)展進(jìn)程中的作用。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分：一、STAT3的激活在AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)中的作用1. Ang Ⅱ引起腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,Ang Ⅱ處理腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E 48 h后,fibronectin, Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ),α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)水平顯著升高,并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。1 μM Ang Ⅱ能夠顯著升高這些促纖維化因子的表達(dá)。2. Ang Ⅱ引起腎小管上皮細(xì)胞中STAT3的激活Western blot結(jié)果顯示,Ang Ⅱ處理能夠激活NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路。AngⅡ處理30 min后JAK2磷酸化上調(diào),而STAT3 Tyr705的磷酸化也顯著升高,峰值為60 min。Ang Ⅱ?qū)RK-52E細(xì)胞中的STAT3 Ser727磷酸化及STAT3 Lys685乙�；A(chǔ)水平?jīng)]有影響。3.姜黃素(Curcumin, Cur)抑制腎小管上皮細(xì)胞中STAT3乙酰化及磷酸化本實(shí)驗(yàn)中使用p300及JAK2的抑制劑Curcumin觀(guān)察JAK2/STAT3信號(hào)通路是否參與了AngⅡ引起的促纖維化反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示,用curcumin (12.5 μM)預(yù)處理細(xì)胞60 min能夠降低STAT3乙酰化水平,并抑制AngⅡ引起的STAT3Tyr705磷酸化水平升高。4. Curcumin抑制AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,curcumin (12.5 μM)預(yù)處理細(xì)胞60 min還能夠降低AngⅡ刺激48 h導(dǎo)致的fibronectin, collagen Ⅳ及TGF-β1表達(dá)上調(diào)。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明STAT3參與了Ang Ⅱ所引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)。二、STAT3 Lys685乙�；cSTAT3 Tyr705磷酸化在AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)中的作用1.抑制STAT3 Lys685乙酰化能夠降低Ang Ⅱ引起的腎小管上皮細(xì)胞STAT3 Tyr705磷酸化水平升高Western blot結(jié)果顯示,SIRT1激動(dòng)劑Resveratrol (12.5μM)或p300 siRNA (50 nM)預(yù)處理細(xì)胞60 min均能夠降低STAT3 Lys685乙�；讲⒆钄郃ng Ⅱ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高,但對(duì)STAT3 Ser727的磷酸化沒(méi)有影響。而細(xì)胞免疫熒光顯示,用p300的選擇性抑制劑C646 (10 μM)預(yù)處理細(xì)胞60 min能夠顯著減少Ang Ⅱ刺激60 min引起的與Tyr705磷酸化水平成正比的STAT3核轉(zhuǎn)移。2.抑制STAT3 Lys685乙酰化能夠減弱Ang Ⅱ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,Resveratrol (12.5 μM)或C646(10μM)預(yù)處理細(xì)胞60min均能夠緩解Ang Ⅱ刺激48 h導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞中fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1及α-SMA表達(dá)上調(diào)。3.抑制Ang Ⅱ引起的腎小管上皮細(xì)胞STAT3 Tyr705磷酸化對(duì)STAT3 Lys685沒(méi)有影響Western blot結(jié)果顯示,酪氨酸激酶JAK2的抑制劑AG490 (12.5 μM)預(yù)處理細(xì)胞60 min降低了Ang Ⅱ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化,但對(duì)STAT3 Ser727磷酸化及STAT3 Lys685沒(méi)有影響。4.抑制腎小管上皮細(xì)胞STAT3 Tyr705磷酸化能夠減弱Ang Ⅱ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,細(xì)胞給予AG490 (12.5 μM)預(yù)處理60 min后,能夠阻斷Ang Ⅱ刺激48h引起的腎小管上皮細(xì)胞fibronectin表達(dá)上調(diào)。5.上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞STAT3乙酰化能夠升高STAT3磷酸化水平,并引起下游促纖維化反應(yīng)5.1 Nicotinamide引起腎小管上皮細(xì)胞STAT3激活并引起促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,SIRT抑制劑nicotinamide處理細(xì)胞48 h能夠顯著升高腎NRK-52E細(xì)胞STAT3 Lys685乙�；蚐TAT3 Tyr705磷酸化水平,同時(shí)伴隨fibronectin、collagen Ⅳ表達(dá)升高,并且成劑量依賴(lài)趨勢(shì)。5.2過(guò)表達(dá)p300引起腎小管上皮細(xì)胞STAT3激活并導(dǎo)致促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,通過(guò)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒過(guò)表達(dá)p30048 h顯著升高了NRK-52E細(xì)胞的p300蛋白水平,并伴隨STAT3 Lys685乙酰化和STAT3 Tyr705磷酸化水平的升高。另外,過(guò)表達(dá)p30048 h還能夠上調(diào)fibronectin, collagen Ⅳ以及TGF-β1蛋白水平。這部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明抑制STAT3 Lys685乙�；c降低AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞中STAT3 Tyr705磷酸化及STAT3介導(dǎo)的促纖維化反應(yīng)密切相關(guān)。STAT3 Tyr705磷酸化是AngⅡ引起的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化反應(yīng)所必須的。上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞STAT3乙酰化水平能夠上調(diào)STAT3磷酸化并引起下游促纖維化反應(yīng)。三、Resveratrol抑制UUO腎臟中STAT3的乙�；⒘姿峄澳I臟纖維化1.UUO引起了腎臟STAT3的激活和促纖維化反應(yīng)Western blot結(jié)果顯示,在小鼠UUO模型中,手術(shù)一天后腎臟STAT3 Tyr705磷酸化顯著升高,但STAT3 Lys685乙�；讲](méi)有明顯變化。纖維化相關(guān)基因fibronectin, collagen Ⅳ及α-SMA在UUO小鼠中顯著升高,從手術(shù)后三天開(kāi)始表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)終止(7天)。2. Resveratrol抑制UUO引起的梗阻腎臟中STAT3的激活以及促纖維化基因的高表達(dá)Western blot結(jié)果顯示,通過(guò)灌胃術(shù)給予UUO小鼠resveratrol (100mg/kg)處理能夠降低STAT3 Lys685乙酰化水平,并緩解UUO所引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高(1天)。Resveratrol灌胃3天能夠抑制UUO引起的梗阻性腎臟中fibronectin, collagen Ⅳ和α-SMA蛋白水平的升高。3. Resveratrol緩解UUO腎臟小管間質(zhì)纖維化馬松染色(masson staining)及蘇木精-伊紅染色(HE staining, hematoxylin-eosin staining)顯示了resveratrol處理后梗阻性腎臟的組織學(xué)變化。在正常與假手術(shù)的小鼠腎臟中,沒(méi)有顯著的腎間質(zhì)纖維化發(fā)生,也沒(méi)有可見(jiàn)的膠原染色。梗阻三天的腎臟表現(xiàn)出小管間質(zhì)纖維化和藍(lán)色的膠原沉積染色。UUO給予resveratrol治療組小鼠的腎小管間質(zhì)纖維化和膠原沉積與UUO組相比顯著減少。這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,提示STAT3乙酰化參與了梗阻性腎病的纖維化進(jìn)程。綜上所述,本課題的研究結(jié)果顯示AngⅡ能夠通過(guò)激活JAK2引起腎小管上皮細(xì)胞STAT3 Tyr705磷酸化水平的升高,并進(jìn)一步導(dǎo)致fibronectin, collagen Ⅳ, a-SMA的表達(dá)上調(diào)；抑制STAT3 Lys685乙�；梢种艫ng Ⅱ引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高及纖維化相關(guān)基因fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1, α-SMA的表達(dá)上調(diào)；抑制STAT3 Tyr705磷酸化能夠抑制Ang Ⅱ引起的腎小管上皮細(xì)胞fibronectin表達(dá)上調(diào),但不影響STAT3 Lys685乙�；剑簧险{(diào)STAT3Lys685乙�；侥軌蛲瑫r(shí)上調(diào)STAT3 Tyr705磷酸化水平并誘導(dǎo)下游的纖維化相關(guān)基因fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1的表達(dá)上調(diào)。另外,在整體上給予SIRT1激動(dòng)劑resveratrol可以降低STAT3 Lys685乙�；⒕徑釻UO小鼠STAT3 Tyr705磷酸化升高及纖維化相關(guān)基因fibronectin, collagen Ⅳ, α-SMA的表達(dá)上調(diào)。HE染色和馬松染色結(jié)果顯示resveratrol可有效緩解UUO引起的腎間質(zhì)纖維化。以上這些結(jié)果提示STAT3乙酰化對(duì)于STAT3信號(hào)通路所介導(dǎo)的腎臟纖維化是不可或缺的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R692

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