發(fā)布時(shí)間：2018-12-13 23:11

【摘要】：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)是慢性腎衰竭-礦物質(zhì)和骨代謝紊亂(Chronic Kidney Disease Mineral and Bone disorder,CKD-MBD)中最為重要的致病因子。慢性腎衰竭中后期,異常升高的FGF23可介導(dǎo)包括心肌肥厚等不良反應(yīng),并與患者的全因死亡率成正相關(guān),成為該類(lèi)疾病預(yù)后不良的標(biāo)志之一。因此尋找慢性腎衰竭中FGF23異常升高的原因并降低其水平具有極為重要的意義。本研究主要目的是比較接受不同透析方式的患者血清FGF23水平的表達(dá)差異,并分析FGF23的相關(guān)因素;從體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究鈣對(duì)FGF23的表達(dá)是否存在調(diào)控作用,并探討鈣促進(jìn)成骨細(xì)胞合成FGF23增多的可能機(jī)制,評(píng)價(jià)干預(yù)療效。該研究將會(huì)進(jìn)一步豐富慢性腎衰竭患者FGF23升高的可能機(jī)制,為臨床上尋找降低慢性腎衰竭患者血清FGF23水平有效手段提供理論依據(jù)。為探究不同透析方式中患者血清FGF23水平表達(dá)差異,我們采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)透析患者血磷、血鈣、鐵蛋白、血紅蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、25羥維生素D、透析前后尿素、肌酐,計(jì)算透析充分性指標(biāo)尿素清除指數(shù)(Kt/V);采用化學(xué)發(fā)光儀法檢測(cè)透析患者全段PTH(intact parathyroid hormone,iPTH)水平。運(yùn)用ELISA法檢測(cè)透析患者血清全段FGF23(intact fibroblast growth factor23,iFGF23)。并用多元回歸分析FGF23與相關(guān)因素之間的關(guān)系。結(jié)果顯示中心夜間透析(INHD)組患者血磷及鈣磷乘積低于傳統(tǒng)透析(CHD)組患者,Kt/V高于CHD組,INHD組患者血磷以及iPTH達(dá)標(biāo)率高于CHD組。血鈣、鐵蛋白、血紅蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯及25羥維生素D等指標(biāo),INHD組與CHD高通組、CHD低通組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。INHD組患者血清FGF23水平低于CHD組,CHD高通組與低通組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素線(xiàn)性回歸結(jié)果顯示血清FGF23水平僅與血鈣、血磷以及鈣磷乘積相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)探究不同因素對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生FGF23的影響及相關(guān)機(jī)制,采用Real-time PCR、免疫熒光染色方法觀察成骨細(xì)胞在各種刺激作用下FGF23的表達(dá)情況。檢測(cè)經(jīng)siRNA干擾下調(diào)鈣敏感受體(CaSR)后FGF23表達(dá)情況。采用茜素紅染色觀察鈣磷刺激下成骨細(xì)胞的礦化情況,同時(shí)采用Real-time PCR檢測(cè)礦化相關(guān)蛋白堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(bone gammacarboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)mRNA表達(dá)情況。運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)鈣磷刺激下,成骨細(xì)胞β-catenin及ERK蛋白表達(dá)情況。并觀察ERK通路抑制劑(U0126)對(duì)成骨細(xì)胞礦化及FGF23表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3刺激促進(jìn)FGF23 mRNA表達(dá)升高,CaCl2、Na2HPO4/NaH2PO4、重組人甲狀旁腺素(rhPTH)刺激成骨細(xì)胞,FGF23 mRNA表達(dá)無(wú)升高,CaCl2聯(lián)合Na2HPO4/NaH2PO4刺激細(xì)胞時(shí),FGF23 mRNA表達(dá)升高。并且5mM Na2HPO4/NaH2PO4+6mM CaCl2組,FGF23 mRNA表達(dá)最高,成骨細(xì)胞FGF23蛋白表達(dá)增強(qiáng)。siRNA干擾下調(diào)CaSR不影響鈣磷刺激成骨細(xì)胞高表達(dá)FGF23。與對(duì)照組對(duì)比,鈣磷刺激條件下促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP、BGP表達(dá)增加和礦化,β-catenin表達(dá)無(wú)差異,PERK蛋白表達(dá)增加。ERK通路抑制劑(U0126)抑制P-ERK蛋白表達(dá)后,成骨細(xì)胞礦化及FGF23表達(dá)下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同鈣飲食對(duì)慢性腎衰竭大鼠FGF23表達(dá)以及骨骼、心肌肥厚及血管鈣化的影響。將大鼠分為不同鈣含量飲食組(高鈣、正常鈣及低鈣組),用Micro-CT檢測(cè)不同飲食干預(yù)后大鼠的脛骨生長(zhǎng)情況。運(yùn)用Real-time PCR檢測(cè)大鼠脛骨組織ALP、BGP、FGF23 mRNA表達(dá)情況。用HE染色觀察不同飲食干預(yù)后大鼠的心肌情況并采用麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin,WGA)染色觀察大鼠心肌膜。采用vonkossa染色觀察不同飲食干預(yù)后大鼠血管以及心肌鈣化情況。用鈣敏感受體激動(dòng)劑NPS R568對(duì)高鈣組大鼠進(jìn)行腹腔注射2周,檢測(cè)飲食干預(yù)以及藥物R568干預(yù)前后大鼠血磷、血鈣、PTH以及大鼠血清iFGF23水平差異。結(jié)果顯示鈣負(fù)荷與FGF23存在正相關(guān)關(guān)系,高鈣CKD組血鈣升高,FGF23水平升高,低鈣CKD組血鈣下降,FGF23水平降低。低鈣野生型組血鈣較正常組無(wú)差異,而FGF23水平較低。低鈣以及正常鈣CKD組骨質(zhì)破壞明顯,高鈣CKD組較CKD另兩組骨質(zhì)量明顯改善。高鈣組脛骨ALP、BGP、FGF23 mRNA表達(dá)高于CKD正常鈣組,這些指標(biāo)在CKD低鈣組表達(dá)低于正常鈣組,與WT大鼠相比,CKD組大鼠心肌肥厚現(xiàn)象明顯。與正常鈣CKD鼠相比,高鈣CKD組心肌肥厚更為嚴(yán)重。高鈣CKD組大鼠心肌存在鈣化現(xiàn)象,其他組未觀察到陽(yáng)性結(jié)果。NPS R568干預(yù)后,大鼠血鈣水平下降,iPTH及iFGF23水平下降。本研究結(jié)果顯示,INHD透析方式較CHD透析方式明顯改善鈣磷代謝,并能降低患者血清iFGF23水平,透析患者血清iFGF23水平與血鈣、血磷以及鈣磷乘積存在明顯正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在一定磷濃度下鈣可刺激成骨細(xì)胞FGF23表達(dá)增加,鈣促進(jìn)FGF23表達(dá)增加不依賴(lài)CaSR和WNT/β-catenin通路,而是通過(guò)ERK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化從而刺激FGF23表達(dá)。高鈣飲食刺激CKD大鼠FGF23表達(dá)上調(diào),介導(dǎo)心肌肥厚加重鈣化,骨的質(zhì)量和礦化影響骨骼FGF23產(chǎn)生,通過(guò)飲食和藥物降低鈣負(fù)荷及鈣磷乘積可顯著下調(diào)血清FGF23水平,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R692.5

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本文編號(hào)：2377423