【摘要】：成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)是慢性腎衰竭-礦物質和骨代謝紊亂(Chronic Kidney Disease Mineral and Bone disorder,CKD-MBD)中最為重要的致病因子。慢性腎衰竭中后期,異常升高的FGF23可介導包括心肌肥厚等不良反應,并與患者的全因死亡率成正相關,成為該類疾病預后不良的標志之一。因此尋找慢性腎衰竭中FGF23異常升高的原因并降低其水平具有極為重要的意義。本研究主要目的是比較接受不同透析方式的患者血清FGF23水平的表達差異,并分析FGF23的相關因素;從體內體外實驗研究鈣對FGF23的表達是否存在調控作用,并探討鈣促進成骨細胞合成FGF23增多的可能機制,評價干預療效。該研究將會進一步豐富慢性腎衰竭患者FGF23升高的可能機制,為臨床上尋找降低慢性腎衰竭患者血清FGF23水平有效手段提供理論依據。為探究不同透析方式中患者血清FGF23水平表達差異,我們采用自動生化分析儀檢測透析患者血磷、血鈣、鐵蛋白、血紅蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯、25羥維生素D、透析前后尿素、肌酐,計算透析充分性指標尿素清除指數(Kt/V);采用化學發(fā)光儀法檢測透析患者全段PTH(intact parathyroid hormone,iPTH)水平。運用ELISA法檢測透析患者血清全段FGF23(intact fibroblast growth factor23,iFGF23)。并用多元回歸分析FGF23與相關因素之間的關系。結果顯示中心夜間透析(INHD)組患者血磷及鈣磷乘積低于傳統(tǒng)透析(CHD)組患者,Kt/V高于CHD組,INHD組患者血磷以及iPTH達標率高于CHD組。血鈣、鐵蛋白、血紅蛋白、白蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、甘油三酯及25羥維生素D等指標,INHD組與CHD高通組、CHD低通組差異無統(tǒng)計學意義。INHD組患者血清FGF23水平低于CHD組,CHD高通組與低通組差異無統(tǒng)計學意義。多因素線性回歸結果顯示血清FGF23水平僅與血鈣、血磷以及鈣磷乘積相關。體外實驗探究不同因素對成骨細胞產生FGF23的影響及相關機制,采用Real-time PCR、免疫熒光染色方法觀察成骨細胞在各種刺激作用下FGF23的表達情況。檢測經siRNA干擾下調鈣敏感受體(CaSR)后FGF23表達情況。采用茜素紅染色觀察鈣磷刺激下成骨細胞的礦化情況,同時采用Real-time PCR檢測礦化相關蛋白堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(bone gammacarboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)mRNA表達情況。運用Western blot方法檢測鈣磷刺激下,成骨細胞β-catenin及ERK蛋白表達情況。并觀察ERK通路抑制劑(U0126)對成骨細胞礦化及FGF23表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3刺激促進FGF23 mRNA表達升高,CaCl2、Na2HPO4/NaH2PO4、重組人甲狀旁腺素(rhPTH)刺激成骨細胞,FGF23 mRNA表達無升高,CaCl2聯(lián)合Na2HPO4/NaH2PO4刺激細胞時,FGF23 mRNA表達升高。并且5mM Na2HPO4/NaH2PO4+6mM CaCl2組,FGF23 mRNA表達最高,成骨細胞FGF23蛋白表達增強。siRNA干擾下調CaSR不影響鈣磷刺激成骨細胞高表達FGF23。與對照組對比,鈣磷刺激條件下促進成骨細胞ALP、BGP表達增加和礦化,β-catenin表達無差異,PERK蛋白表達增加。ERK通路抑制劑(U0126)抑制P-ERK蛋白表達后,成骨細胞礦化及FGF23表達下降。體內實驗檢測不同鈣飲食對慢性腎衰竭大鼠FGF23表達以及骨骼、心肌肥厚及血管鈣化的影響。將大鼠分為不同鈣含量飲食組(高鈣、正常鈣及低鈣組),用Micro-CT檢測不同飲食干預后大鼠的脛骨生長情況。運用Real-time PCR檢測大鼠脛骨組織ALP、BGP、FGF23 mRNA表達情況。用HE染色觀察不同飲食干預后大鼠的心肌情況并采用麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutinin,WGA)染色觀察大鼠心肌膜。采用vonkossa染色觀察不同飲食干預后大鼠血管以及心肌鈣化情況。用鈣敏感受體激動劑NPS R568對高鈣組大鼠進行腹腔注射2周,檢測飲食干預以及藥物R568干預前后大鼠血磷、血鈣、PTH以及大鼠血清iFGF23水平差異。結果顯示鈣負荷與FGF23存在正相關關系,高鈣CKD組血鈣升高,FGF23水平升高,低鈣CKD組血鈣下降,FGF23水平降低。低鈣野生型組血鈣較正常組無差異,而FGF23水平較低。低鈣以及正常鈣CKD組骨質破壞明顯,高鈣CKD組較CKD另兩組骨質量明顯改善。高鈣組脛骨ALP、BGP、FGF23 mRNA表達高于CKD正常鈣組,這些指標在CKD低鈣組表達低于正常鈣組,與WT大鼠相比,CKD組大鼠心肌肥厚現(xiàn)象明顯。與正常鈣CKD鼠相比,高鈣CKD組心肌肥厚更為嚴重。高鈣CKD組大鼠心肌存在鈣化現(xiàn)象,其他組未觀察到陽性結果。NPS R568干預后,大鼠血鈣水平下降,iPTH及iFGF23水平下降。本研究結果顯示,INHD透析方式較CHD透析方式明顯改善鈣磷代謝,并能降低患者血清iFGF23水平,透析患者血清iFGF23水平與血鈣、血磷以及鈣磷乘積存在明顯正相關。體外實驗結果顯示在一定磷濃度下鈣可刺激成骨細胞FGF23表達增加,鈣促進FGF23表達增加不依賴CaSR和WNT/β-catenin通路,而是通過ERK通路促進成骨細胞礦化從而刺激FGF23表達。高鈣飲食刺激CKD大鼠FGF23表達上調,介導心肌肥厚加重鈣化,骨的質量和礦化影響骨骼FGF23產生,通過飲食和藥物降低鈣負荷及鈣磷乘積可顯著下調血清FGF23水平,具有潛在的臨床應用價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692.5

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