【摘要】：背景 腎積水等所致腎纖維化,尤其是腎小管間質(zhì)纖維化(TIF),幾乎是所有的慢性進(jìn)展性腎臟疾病的共同結(jié)局,同時(shí)腎纖維化也是判斷腎功能預(yù)后的重要指標(biāo)之一。已有研究表明,TGF-β1是一種功能強(qiáng)大的促進(jìn)纖維變性的纖維生成因子,而LeftyA及其相關(guān)蛋白在胚胎發(fā)育中能夠抑制TGF-β1信號傳遞。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：腎重度積水患者的腎組織中,LeftyA基因極低表達(dá)。據(jù)此,我們推斷LeftyA蛋白可能具有抗腎臟纖維化的功能。在本研究中,通過構(gòu)建pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)使之高表達(dá)TGF-β1蛋白,從而誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(MMP-2/9),而后者導(dǎo)致腎小管上皮肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)并對腎小管基膜造成損傷,此公認(rèn)為腎纖維化的重要機(jī)制之一。本研究旨在明確：LeftyA能否拮抗TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶,進(jìn)而減輕腎纖維化。 第一部分人TGF-β1基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞MMP-2/9表達(dá)變化 目的：通過構(gòu)建pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表達(dá)載體,建立TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,探討轉(zhuǎn)染人TGF-β1基因?qū)?xì)胞分泌MMP2/9的影響。 方法：以載有TGF-β1的克隆載體pM19-TSimple為模板,PCR反應(yīng)獲得TGF-β1編碼區(qū)DNA,酶切和連接插入pcDNA3.str/Neo(+)構(gòu)建TGF-β1真核表達(dá)載體,LipofactamineTM2000將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HK-2細(xì)胞,新霉素(neomycin)篩選,構(gòu)建TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；RT-PCR及Western blot檢測此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中mRNA及TGF-β1蛋白的表達(dá),Western blot檢測MMP-2/9蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出TGF-β1編碼區(qū)片段,酶切、瓊脂糖電泳及基因測序均證實(shí)pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表達(dá)載體成功構(gòu)建；新霉素(neomycin)篩選得到高表達(dá)TGF-β1蛋白的HK-2細(xì)胞系；RT-PCR和Western blot證實(shí)此細(xì)胞系高表達(dá)mRNA及TGF-β1蛋白。Vestern blot證實(shí)MMP-2/9表達(dá)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：pcDNA3.str/Neo(+)-TGF-β1真核表達(dá)載體成功構(gòu)建,TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立,Western blot證實(shí)MMP-2/9表達(dá)明顯增強(qiáng),為研究LeftyA蛋白抗腎纖維化奠定了基礎(chǔ)。 第二部分LeftyA拮抗TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞分泌MMP-2/9對腎纖維化的影響 目的：探討在人腎小管上皮細(xì)胞中LeftyA拮抗TGF-β1誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶對腎纖維化的影響。 方法：通過轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞,建立TGF-β1、LeftyA+TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,分別觀察細(xì)胞形態(tài),檢測正常HK-2細(xì)胞、TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系和LeftyA+TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中的MMP-2/9蛋白、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及相應(yīng)mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果：光鏡顯示：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1的HK-2細(xì)胞呈長梭形,LeftyA轉(zhuǎn)染TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,可顯著抑制這種形態(tài)改變。與正常HK-2細(xì)胞相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)下調(diào),α-SMA與MMP-2/9表達(dá)明顯上調(diào)。在LeftyA轉(zhuǎn)染TGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中,LeftyA蛋白上調(diào)表達(dá)可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞內(nèi)E-cadherin的下調(diào)表達(dá)(P0.05),并逆轉(zhuǎn)α-SMA和MMP-2、9上調(diào)表達(dá)(P0.05)。 結(jié)論：在腎小管上皮細(xì)胞中,TGF-β1誘導(dǎo)分泌MMP2/9,而LeftyA可拮抗此事件,減輕MMP-2/9對腎小管基底膜的損傷。LeftyA通過抑制TGF-β1經(jīng)MMP-2/9介導(dǎo)的上皮肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT),從而減輕腎纖維化,發(fā)揮抗纖維化作用。 第三部分LeftyA拮抗TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞分泌MMP-2/9機(jī)制探討 目的：探討在人腎小管上皮細(xì)胞中LeftyA拮抗TGF-β1誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2/9的機(jī)制。 方法：在HK-2細(xì)胞中分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.str-TGF-β1與pcDNA3.str-TGF-β1+pcDNA3.1-Lefty A, Western blot分別檢測3種細(xì)胞p-Smad3蛋白,p-JNK蛋白、p-ERK及p-p38MAPK蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.str-TGF-β1即可誘導(dǎo)p-Smad3、p-JNK、p-ERK以及p-p38MAPK蛋白激活表達(dá)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.str-TGF-β1的HK-2細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LeftyA, Lefty A蛋白表達(dá)上調(diào),抑制TGF-β1對Smad3、JNK、ERK與p38MAPK的激活。 結(jié)論：在人腎小管上皮細(xì)胞中,LeftyA蛋白通過抑制Smad信號通路及JNK、ERK與p38MAPK信號通路拮抗TGF-β1誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2/9。
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【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Lixia Yang;Xinhuan Ma;Tao Cheng;Tonghua Liu;Lili Wu;Wen Sun;Margetts Peter Joseph;;Effect of Tangnaikang on TGF-β_1-induced transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2013年03期

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本文編號：2371957