【摘要】：目的:評(píng)估γ分泌酶抑制劑PF-03084014對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路的抑制作用,觀察癌細(xì)胞對(duì)多烯紫杉醇化療的敏感性改變,并進(jìn)一步探索PF-03084014提高多烯紫杉醇化療敏感度的分子機(jī)制。方法:(1)體外實(shí)驗(yàn):利用人前列腺癌細(xì)胞系DU145和PC3,多烯紫杉醇抵抗型DU145R和PC3R細(xì)胞,分別用DMSO、PF-03084014、多烯紫杉醇、多烯紫杉醇+PF-03084014孵育,測(cè)定細(xì)胞存活和NICD的表達(dá)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立軟組織和骨轉(zhuǎn)移灶前列腺癌小鼠模型,當(dāng)腫瘤體積達(dá)到基線后,隨機(jī)分為四組,進(jìn)行以下處理:對(duì)照、口服PF-03084014、注射多烯紫杉醇、PF-03084014+多烯紫杉醇聯(lián)合治療。每周兩次評(píng)估腫瘤的生長(zhǎng)情況。待處理周期結(jié)束后,獲取腫瘤組織。免疫組化定量測(cè)定腫瘤組織中Ki67,cleaved-caspase 3和CD31的表達(dá)。PCR測(cè)定組織中HEY1和HEY2 mRNA的表達(dá)。Western blot方法來(lái)測(cè)定NICD,Cyclin E,BCL-2,BCL-xl,BAK,BAX,MEK1/2,phosphor-MEK1/2(ser217/221),ERK1/2,phosphor-ERK1/2(T202/Y204),AKT,phosphor-AKT(ser473),PI3K,phosphor-PI3K(tyr455/199),EGFR,P52,E-cadherin,Snail,Slug,MDR1,NANOG的表達(dá)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定組織細(xì)胞中ALDH的表達(dá),無(wú)血清培養(yǎng)基下測(cè)定組織細(xì)胞懸浮成球能力。結(jié)果:(1)體外實(shí)驗(yàn):PF-03084014抑制前列腺癌DU145,PC3和DU145R,PC3R細(xì)胞的生長(zhǎng)和NICD的表達(dá),并成濃度和時(shí)間依賴性。PF-03084014增強(qiáng)DU145R,PC3R對(duì)多烯紫杉醇的敏感度。(2)在多烯紫杉醇敏感型細(xì)胞皮下成瘤模型中,單獨(dú)使用PF-03084014使DU145腫瘤的生長(zhǎng)降低39.7%,PC3腫瘤降低28.9%;多烯紫杉醇處理組中,DU145腫瘤體積縮小36.1%,PC3縮小38.5%;而聯(lián)合用藥組DU145和PC3腫瘤體積分別降低了64.1%和56.6%。而四種不同處理組中小鼠體重并沒有顯著的差異(P=0.5786)。對(duì)于耐藥型細(xì)胞皮下成瘤模型,單獨(dú)使用PF-03084014使DU145R和PC3R分別下降45%和35%。而高濃度的多烯紫杉醇(10mg/kg)使DU145R和PC3R下降36%和18%。兩種藥物的聯(lián)合治療PC3R和DU145R腫瘤體積分別下降了74.4%和56.7%。對(duì)于耐藥型細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移灶模型,多烯紫杉醇的處理并沒有對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。而使用PF-03084014后,多烯紫杉醇的處理對(duì)耐藥腫瘤重新產(chǎn)生抑制作用。免疫組化結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,PF-03084014組中Ki67陽(yáng)性率減少了19.8%,聯(lián)合用藥組減少了48%;PF-03084014組cleaved-caspase3的表達(dá)增加了1.9倍,聯(lián)合用藥組中升高了6.7倍。(3)在DU145皮下腫瘤中,PF-03084014組中Ki67表達(dá)相較于對(duì)照組下降了42.5%,cleaved-caspase3的表達(dá)上升了91%,微血管密度下降了84.4%;聯(lián)合用藥組,三種蛋白的表達(dá)的改變率為-68.3%,+290.6%,-88.4%。口服PF-03084014后,DU145和DU145R腫瘤組織中NICD-1蛋白的表達(dá)和Notch通路靶基因HEY1和HEY2 mRNA的表達(dá)均下降;細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinE的表達(dá)下降;促凋亡蛋白BAK和BAX表達(dá)升高,而抗凋亡蛋白BCL-XL和Bcl-2表達(dá)下降;DU145細(xì)胞中MEK-ERK通路磷酸化水平下降,DU145R細(xì)胞中AKTPI3K的磷酸化水平也被抑制;E-cadherin的表達(dá)上升,波形蛋白vimentin和EMT轉(zhuǎn)錄因子snail,slug的表達(dá)受到抑制;多重耐藥相關(guān)蛋白MDR1的表達(dá)下降;表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR表達(dá)下降;NFkB家族蛋白P52的表達(dá)也下降。與對(duì)照組相比,喂養(yǎng)PF-03084014后,腫瘤組織中高表達(dá)ALDH的細(xì)胞比例降低,干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子NANOG的表達(dá)也降低。與多烯紫杉醇組相比,聯(lián)合用藥組中的DU145懸浮微球生成率下降,停藥后腫瘤再生長(zhǎng)的倍增時(shí)間降低。結(jié)論:在軟組織和骨轉(zhuǎn)移灶環(huán)境中,PF-03084014通過(guò)抑制Notch通路使CRPC細(xì)胞內(nèi)促生長(zhǎng)的信號(hào)減弱,促凋亡的信號(hào)增強(qiáng),最終抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)它還通過(guò)抑制與耐藥相關(guān)的多種途徑,使多烯紫杉醇耐藥型CRPC細(xì)胞再次對(duì)多烯紫杉敏感。這為聯(lián)合PF-03084014和多烯紫杉醇的臨床應(yīng)用提供了必要的前期基礎(chǔ),為更有效的治療CRPC提供了新的解決思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：2370738