【摘要】：研究目的:前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤,在歐美國家男性腫瘤發(fā)病率常年排名首位。近幾年,我國男性前列腺癌發(fā)病率也快速增長,成為備受關(guān)注的一種惡性腫瘤。目前,前列腺癌的主要的治療方案包括手術(shù)治療、放射治療及內(nèi)分泌治療等。對于晚期前列腺癌來說,內(nèi)分泌治療是主要的治療方法。然而,當(dāng)經(jīng)過一定時間內(nèi)分泌治療后,大部分患者會面臨腫瘤的復(fù)發(fā),逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?Castration resistant prostate cancer,CRPC)。一旦進入該期,針對前列腺癌的治療大多無效。因此,CRPC的治療成為臨床治療的難點及前列腺癌研究的熱點。泛素化修飾(Ubiquitin modification),是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-Translational Modification),它能夠通過對特定底物蛋白進行泛素化修飾從而影響底物蛋白的降解、活化或細(xì)胞內(nèi)定位的改變。因此,它在細(xì)胞的正常生理活動中發(fā)揮不可缺少的作用。但當(dāng)它的功能出現(xiàn)異常,也可能導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂進而導(dǎo)致疾病包括腫瘤的發(fā)生。已有大量研究表明,泛素化修飾在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用。去泛素化酶(Deubiquitinases,DUBs)是泛素化修飾過程中一種能逆轉(zhuǎn)泛素化修飾的關(guān)鍵酶,它在腫瘤進展過程中的新功能、新機制也一直是腫瘤研究中的重點。既往研究報道顯示去泛素化酶USP33(Ubiquitin specific protease 33)在雄激素刺激前列腺癌細(xì)胞后的表達(dá)量有明顯升高,因此認(rèn)為它可能在前列腺癌生長中發(fā)揮一定作用,遂本課題的研究目的是探討USP33在前列腺癌(尤其是去勢抵抗性前列腺癌)中的作用及機制。研究方法:培養(yǎng)前列腺各細(xì)胞系,包括RWPE,Ln Cap,PC3,DU145,Ln Cap-AI,C4-2,22RV1。采用RT-PCR方法檢測USP33在各細(xì)胞系中的表達(dá)量,通過免疫組化檢測USP33在前列腺癌組織及前列腺增生組織中的表達(dá)量并比較其差異。采用流式技術(shù)檢測USP33對PC3細(xì)胞凋亡的影響。通過CCK8及Transwell實驗分別檢測USP33對前列腺細(xì)胞的生長、遷移及侵襲能力的影響。用免疫共沉淀及質(zhì)譜分析尋找與USP33相結(jié)合的靶蛋白,通過western blotting驗證USP33與靶蛋白的結(jié)合,并研究其對靶蛋白的修飾方式分析及作用通路。建立裸鼠的皮下荷瘤模型及瘤內(nèi)注射干擾RNA的治療模型。結(jié)果:本研究發(fā)現(xiàn)USP33在前列腺癌尤其是雄激素非依賴(Androgen Independent,AI)前列腺癌細(xì)胞的生長過程中發(fā)揮著重要的作用。在不同來源的前列腺癌細(xì)胞中,前列腺癌細(xì)胞中的USP33表達(dá)量明顯高于正常前列腺細(xì)胞,其中又以雄激素非依賴細(xì)胞中更明顯。在臨床收集的前列腺標(biāo)本中,我們也發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中的USP33表達(dá)量明顯高于前列腺增生組織。在不同前列腺癌細(xì)胞系中,通過干擾及過表達(dá)等實驗方法,發(fā)現(xiàn)USP33能夠促進前列腺癌細(xì)胞包括雄激素非依賴前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。PC3細(xì)胞是用于研究雄激素非依賴前列腺癌的經(jīng)典細(xì)胞系,因此在之后的實驗中成為本課題主要研究的細(xì)胞系。PC3細(xì)胞的主要特點是不表達(dá)雄激素受體AR(Androgen Receptor)。在PC3細(xì)胞中干擾或過表達(dá)USP33之后,結(jié)果顯示USP33可以抑制PC3細(xì)胞的凋亡。利用Western blotting技術(shù),發(fā)現(xiàn)干擾了USP33能夠增加PC3細(xì)胞中磷酸化JNK和P38的水平。利用免疫共沉淀及質(zhì)譜分析技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)USP33可以和DUSP1(Dual specificity protein phosphatase 1)相互結(jié)合,并且能夠通過逆轉(zhuǎn)DUSP1的K48多聚泛素化修飾而抑制它的降解從而增加DUSP1的表達(dá)量。在臨床標(biāo)本中,我們發(fā)現(xiàn)USP33高表達(dá)的前列腺癌組織中也伴隨著DUSP1的高表達(dá)。因為DUSP1在以往的報道中能夠通過抑制JNK1/2和P38的活化而抑制不同細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞的凋亡,因此我們也檢測了USP33對AI細(xì)胞PC3凋亡的影響。我們發(fā)現(xiàn),干擾了USP33能夠明顯促進PC3細(xì)胞的凋亡,但當(dāng)體系中加入DUSP1過表達(dá)質(zhì)粒或JNK1/2和P38的抑制劑后,這種效應(yīng)就得到了逆轉(zhuǎn)。通過荷瘤小鼠干擾RNA治療模型,我們發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)注射USP33的小干擾RNA能明顯減緩PC3細(xì)胞荷瘤組織的生長。結(jié)論:在前列腺癌細(xì)胞尤其是雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞中,USP33能夠通過去除DUSP1的K48多聚泛素化修飾,從而抑制其通過泛素蛋白酶體途徑的降解過程,提高其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá),進一步通過DUSP1的磷酸酶活性抑制JNK1/2和P38信號通路的活化從而抑制JNK1/2、P38依賴的細(xì)胞凋亡并影響細(xì)胞的生長。該研究創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)了USP33在前列腺癌細(xì)胞中的新功能,同時發(fā)現(xiàn)了它新的作用底物DUSP1以及對DUSP1的調(diào)控方式,也為雄激素非依賴前列腺癌的治療提供了潛在的治療靶點,為雄激素非依賴前列腺癌的研究提供了新的參考。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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1 過菲;去泛素化酶USP33在去勢抵抗性前列腺癌中的作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

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本文編號：2356610