【摘要】：以腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)為代表的腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,由于其對(duì)放化療及生物免疫治療缺乏敏感,故成為腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等晚期病人預(yù)后差的關(guān)鍵因素。深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理,并探尋合適的標(biāo)靶是當(dāng)前該病診斷、治療及預(yù)后的潛在方向。在腎透明細(xì)胞癌中,SETD2基因是僅次于VHL和PBRM1的第三大抑癌基因,而有關(guān)它的表達(dá)缺失或下調(diào)機(jī)制,目前尚不明晰。微小RNA (miRNA)是一類短鏈非編碼RNA,通過在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因,下調(diào)靶基因表達(dá)并影響其所在的信號(hào)通路傳導(dǎo),從而在生物體生命活動(dòng)尤其是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中扮演重要角色。結(jié)合生物信息學(xué)及相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件,我們發(fā)現(xiàn)miRNA與SETD2存在潛在的關(guān)聯(lián)性,即SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能源于某一或某些miRNAs的負(fù)性調(diào)控。因此,本研究旨在從miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面著手探索SETD2表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制,以闡明SETD2及相關(guān)miRNAs對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為未來的臨床診治提供理論依據(jù)。我們將通過檢測(cè)SETD2基因及各預(yù)測(cè)候選miRNAs在人ccRCC中的表達(dá)水平,揭示它們?cè)赾cRCC臨床診斷與治療中的潛在意義；通過體外實(shí)驗(yàn),探索并驗(yàn)證ccRCC中靶向調(diào)控SETD2的miRNAs;研究miRNA調(diào)控SETD2對(duì)ccRCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并探索其潛在的作用機(jī)制。本研究分為以下三個(gè)部分： 第一部分SETD2基因及各預(yù)測(cè)miRNAs在人腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)研究 目的：檢測(cè)人正常腎組織與腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)組織及細(xì)胞中SETD2基因、各預(yù)測(cè)miRNAs的表達(dá)差異,篩選與SETD2潛在關(guān)聯(lián)的miRNA(s)。 方法：采用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和western blot法分別檢測(cè)40例臨床組織標(biāo)本及細(xì)胞系中SETD2基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)量,并分析其表達(dá)差異。隨機(jī)選取30例配對(duì)ccRCC組織與正常腎組織,采用免疫組織化學(xué)染色法(IHC)檢測(cè)并分析SETD2蛋白在正常腎與癌組織中的表達(dá)差異。應(yīng)用Target-Scan microRNA.org、miRWalk等多個(gè)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件逆向篩選可能靶向作用于SETD2基因的miRNAs,同時(shí)結(jié)合在線ccRCC的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫,篩選出可能調(diào)控SETD2的]miRNAs。采用qPCR檢測(cè)各預(yù)測(cè)miRNAs在細(xì)胞系及組織標(biāo)本中的表達(dá)水平并比較其差異,同時(shí)分析各預(yù)測(cè)miRNAs與SETD2表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果：相較正常腎組織,SETD2基因的mRNA在77.50%(31/40)的ccRCC組織中顯著下調(diào),而SETD2蛋白表達(dá)水平在65.00%(26/40)的ccRCC組織中顯著下調(diào)。相較HK-2細(xì)胞系,786-0和SN12-PM6細(xì)胞中的SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示SETD2蛋白在正常腎組織中76.67%(23/30)呈強(qiáng)陽性表達(dá),13.33%(4/30)呈弱陽性表達(dá),10.00%(3/30)為低表達(dá)；在ccRCC組織中,80.00%(24/30)呈低表達(dá)或無表達(dá),16.67%(5/30)呈弱陽性表達(dá),3.33%(1/30)為強(qiáng)陽性表達(dá)。miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p被篩選作為可能調(diào)控SETD2基因的候選miRNAs。相較HK-2細(xì)胞系,miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p在786-0和SN12-PM6細(xì)胞系中均高表達(dá),而miR-20a-5p表達(dá)差異不明顯。相較正常腎組織,miR-23b-5p. miR-34b-3p、miR-106b-5p、miR-142-5p和miR-20a-5p在ccRCC中顯著上調(diào)的比例分別為：60.00%(24/40)、55.00%(22/40)、67.50%(27/40)、47.50%(19/40)和35.00%(14/40)。經(jīng)t檢驗(yàn)分析顯示在ccRCC組織與正常腎組織中表達(dá)有顯著差異的miRNAs分別是：miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p和miR-142-5p。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在ccRCC組織中SETD2的mRNA水平與miR-23b-5p、miR-34b-3p、miR-106b-5p表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。 結(jié)論：在ccRCC中,SETD2基因是一個(gè)重要的抑癌基因,其表達(dá)缺失或下調(diào)可能與候選miRNAs:miR-23b-5p、miR-34b-3p和miR-106b-5p的異常上調(diào)有關(guān)。 第二部分在腎透明細(xì)胞癌中miR-106b-5p靶向調(diào)控SETD2及其機(jī)制研究 目的：在miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平探索SETD2基因在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)缺失或下調(diào)的機(jī)制。 方法：采用化學(xué)合成法獲得各預(yù)測(cè)miRNAs的抑制劑anti-miRNAs及模擬物mimics,分別將其轉(zhuǎn)入ccRCC細(xì)胞系786-0和SN12-PM6,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及western blot法檢測(cè)SETD2基因mRNA和蛋白的表達(dá)變化。構(gòu)建含SETD2基因3'-UTR野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告載體,采用雙熒光素酶法進(jìn)行檢測(cè)分析以探索候選miRNAs對(duì)SETD2的調(diào)控方式。設(shè)計(jì)“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn),將小干擾RNA si-SETD2與候選miRNA的抑制劑共轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞系,應(yīng)用qPCR和western blot法分別檢測(cè)SETD2基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化,進(jìn)一步探索候選miRNA對(duì)SETD2基因可能的調(diào)控作用。結(jié)果：轉(zhuǎn)入各預(yù)測(cè)miRNAs的抑制劑后,僅anti-miR-106b-5p使786-0和SN12-PM6細(xì)胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。而反過來,向786-0和SN12-PM6細(xì)胞系中轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后,SETD2基因的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。雙熒光素酶檢測(cè)分析結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的模擬物mimic后,HK-2、786-0和SN12-PM6細(xì)胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性明顯降低,而3’-UTR突變型無顯著影響。相反,在轉(zhuǎn)入miR-106b-5p的抑制劑后,786-O和SN12-PM6細(xì)胞系中SETD2基因3’-UTR野生型的熒光素酶活性顯著提高,而3’-UTR突變型無明顯改變。另外,在“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)入anti-miR-106b-5p可使786-0和SN12-PM6細(xì)胞系中的SETD2基因mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而同時(shí)轉(zhuǎn)入si-SETD2將逆轉(zhuǎn)anti-miR-106b-5p轉(zhuǎn)入所致的SETD2表達(dá)上調(diào)作用。 結(jié)論：SETD2基因是miR-106b-5p的一個(gè)新的靶基因,在腎透明細(xì)胞癌中SETD2基因的表達(dá)缺失或下調(diào)可能是由于miR-106b-5p的過表達(dá)所致。 第三部分miR-106b-5p調(diào)控SETD2對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究 目的：研究miR-106b-5p調(diào)控SETD2對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在影響,并探索其作用機(jī)制。 方法：同前述“逆轉(zhuǎn)”實(shí)驗(yàn),將轉(zhuǎn)染分為5組,即anti-NC+si-NC、anti-miR-106b-5p+si-NC、si-NC、si-SETD2和anti-miR-106b-5p+si-SETD2,分別轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞系786-O與SN12-PM6,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期和凋亡的可能變化,并采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖的改變。同時(shí),我們采用qPCR與western blot法分別檢測(cè)上述各組轉(zhuǎn)染情況下腎癌細(xì)胞中p53、caspase3的表達(dá)變化。同時(shí)提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的核蛋白,western blot法檢測(cè)核蛋白H3K36me3可能的表達(dá)變化。另外,通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-106b-5p調(diào)控si-SETD2對(duì)p53啟動(dòng)子活性可能的影響,并應(yīng)用ChIP技術(shù)探索p53基因啟動(dòng)子與H3K36me3的潛在關(guān)系。 結(jié)果：流式細(xì)胞周期、凋亡檢測(cè)及EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示在786-0與SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p均可使兩種腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,即G0/G1比例增加,而S期減少,且細(xì)胞增殖明顯減少,細(xì)胞凋亡明顯增加,而干擾SETD2表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展,即G0/G1期減少,S期增多,且細(xì)胞增殖明顯增加,細(xì)胞凋亡明顯減少。此外,干擾SETD2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默miR-106b-5p所致的細(xì)胞周期阻滯、凋亡增加和增殖抑制效應(yīng)。qPCR結(jié)果顯示在786-0與SN12-PM6細(xì)胞中,沉默miR-106b-5p可使p53基因mRNA明顯上調(diào),而干擾SETD2表達(dá)一方面使p53mRNA明顯下調(diào),另一方面還可逆轉(zhuǎn)沉默miR-106b-5p所致的p53基因mRNA上調(diào)效應(yīng)。各轉(zhuǎn)染組caspase-3基因的mRNA變化無明顯改變。Western blot結(jié)果顯示在沉默miR-106b-5p后,786-0與SN12-PM6細(xì)胞中p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase-3蛋白(cleaved caspase-3)的表達(dá)顯著增加,而前體caspase-3蛋白(procaspase-3)明顯下調(diào)；相較對(duì)照組,干擾SETD2表達(dá)可使p53蛋白、H3K36me3蛋白、活化型caspase3蛋白(cleaved caspase-3)表達(dá)下調(diào),而前體caspase3蛋白(procaspase-3)增加；此外,干擾SETD2可逆轉(zhuǎn)沉默miR-106b-5p所致的p53、H3K36me3、cleaved caspase-3三種蛋白上調(diào)及procaspase-3蛋白下調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在786-O與SN12-PM6中,沉默miR-106b-5p可使H3K36me3與p53啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)結(jié)合量顯著增加,p53啟動(dòng)子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性也明顯增加；而干擾SETD2表達(dá)則使H3K36me3與p53啟動(dòng)子區(qū)的相對(duì)結(jié)合量顯著減少,p53啟動(dòng)子載體的螢火蟲/海腎熒光素酶活性亦明顯減少；此外,干擾SETD2也逆轉(zhuǎn)了沉默miR-106b-5p所致的H3K36me3與p53啟動(dòng)子區(qū)相對(duì)結(jié)合量增加,及p53啟動(dòng)子螢火蟲／海腎熒光素酶活性增加的效應(yīng)。 結(jié)論：miR-106b-5p對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的周期、凋亡及增殖的影響依賴于其對(duì)SETD2的直接靶向調(diào)控,"miR-106b-5p—SETD2—H3K36me3—p53/caspase-3"軸可能參與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2334072