【摘要】：研究目的和背景 大自噬(簡稱為“自噬”)是細(xì)胞進(jìn)化進(jìn)程中的重要保守過程，其通過隔離細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚物等，并將這些細(xì)胞代謝垃圾輸送到溶酶體降解，其在細(xì)胞中扮演著管家的功能維持著細(xì)胞生物功能的質(zhì)量和數(shù)量。目前，大量研究表明自噬調(diào)控途徑和/或自噬相關(guān)蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)和控制免疫反應(yīng)以及炎癥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬紊亂參與了人體多種炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和病理進(jìn)展，如：Crohn氏病，囊性纖維化肺疾病，糖尿病，肝臟疾病和腸道炎癥等。 膀胱疼痛綜合癥/間質(zhì)膀胱炎(BPS/IC)是泌尿科處理棘手膀胱炎癥疾病，其特點(diǎn)為尿頻、尿急、盆腔疼痛以及泌尿道其他不適。迄今為止，對(duì)于BPS/IC的病理生理尚未闡明，目前存在多種學(xué)說如：感染、自身免疫、尿液毒性物、膀胱上皮障礙以及神經(jīng)炎癥等。但炎癥和免疫紊亂在起發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。 血管、氣道、陰莖等組織平滑肌細(xì)胞自噬目前已經(jīng)被證實(shí)存在，并且自噬在其中扮演這重要的保護(hù)功能和作用。然而，膀胱平滑肌細(xì)胞是否存在自噬以及其介導(dǎo)自噬是否參與了BPS/IC的病理生理目前尚未見報(bào)道。環(huán)磷酰胺(CYP)是一種有效的抗腫瘤性疾病的化療藥物，已被廣泛的運(yùn)用于抗腫瘤治療中，丙烯醛是其毒性代謝物，該物質(zhì)能誘發(fā)嚙齒類動(dòng)物膀胱炎癥反應(yīng)，因此其已被廣泛用來研究炎癥和免疫紊亂在膀胱炎癥疾病中作用和意義(包括BPS/IC)。據(jù)此，本研究旨在探討膀胱逼尿肌肌細(xì)胞是否存在自噬以及自噬在BPS/IC和環(huán)磷酰胺誘發(fā)膀胱炎動(dòng)物模型中的功能和作用。 方法： 在第一部分中，我們主要目的為討探自噬是否存在人類和大鼠逼尿肌肌細(xì)胞。首先，搜集人類和大鼠的膀胱組織。其次，透射電子顯微鏡(TEM)和雙標(biāo)記免疫熒光分別檢測(cè)人和大鼠逼尿肌肌細(xì)胞自噬小體和LC3和α-SMCA的共定位。三，免疫印跡和RT-PCR方法證實(shí)LC3蛋白和基因的表達(dá)。 在第二部分中，我們探索了人對(duì)照組膀胱和BPS/IC膀胱之間的自噬的變化以及膀胱組織學(xué)變化。首先，搜集病人膀胱組織。第二，透射電子顯微鏡(TEM)和雙標(biāo)記免疫熒光法分別用于檢測(cè)逼尿肌肌細(xì)胞自噬和LC3的熒光斑點(diǎn)的變化。第三，蛋白印跡法確認(rèn)LC3蛋白的表達(dá)。第四，HE和甲苯胺藍(lán)染色法用于組織學(xué)評(píng)分和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)。 在第三部分中，我們研究了逼尿肌肌細(xì)胞自噬在環(huán)磷酰胺誘發(fā)膀胱炎動(dòng)物模型的功效。首先，動(dòng)物組分類和動(dòng)物模型建立。第二，透射電子顯微鏡(TEM)和雙標(biāo)記免疫熒光法分別用于檢測(cè)逼尿肌肌細(xì)胞自噬體和在每個(gè)組的LC3熒光斑點(diǎn)的變化。第三，蛋白印跡法確認(rèn)LC3、P-P70S6K和SOD2蛋白在各組的表達(dá)。第四，HE和甲苯胺藍(lán)染色法用于每一個(gè)組組織學(xué)評(píng)分和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)。第五， ELISA法測(cè)定IL-1β、IL-6， IL-8，MDA和GSH在各組的表達(dá)。六，尿動(dòng)力學(xué)用于評(píng)估各組大鼠膀胱功能改變情況。 結(jié)果 1.通過電鏡，免疫印跡， RT-PCR和免疫熒光雙標(biāo)記等我們證實(shí)逼尿肌肌細(xì)胞存在自噬小體和自噬相關(guān)的標(biāo)志物蛋白和基因LC3. 2.與對(duì)照組病人膀胱組織相比，IC病人的膀胱組織上皮明顯變薄、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤固有層和肌肉層。此外，定量評(píng)價(jià)表明浸潤到肌肉層的肥大細(xì)胞數(shù)相對(duì)于對(duì)照組顯著增加。運(yùn)用電子顯微鏡，免疫熒光雙標(biāo)記和免疫印跡技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)于對(duì)照組相比，逼尿肌肌細(xì)胞自噬在IC患者中顯著增加，但其清除細(xì)胞受損的細(xì)胞器功能明顯降低，通過電鏡我們發(fā)現(xiàn)在IC患者逼尿肌細(xì)胞中，受傷的細(xì)胞器，包括線粒體并沒有被自噬體所包裹。 3.在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎中，逼尿肌細(xì)胞自噬的激活通過LC3斑點(diǎn)表達(dá)和P70S6K蛋白表達(dá)增加以及自噬體數(shù)目增加而證實(shí)。在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎中，逼尿逼細(xì)胞自噬激活的不充分，導(dǎo)致了炎癥和氧化應(yīng)激增強(qiáng)以及膀胱出現(xiàn)過度的活動(dòng)。在使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理過的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎中，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著降低，膀胱組織學(xué)和尿動(dòng)力學(xué)功能得到顯著改善。與此相反，，使用自噬拮抗劑氯喹預(yù)處理過的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠膀胱炎中，炎癥和氧化應(yīng)激顯著增加，膀胱組織學(xué)和膀胱功能嚴(yán)重受傷。 結(jié)論 1.我們通過電鏡、免疫熒光、western blot優(yōu)先證實(shí)了人和大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞存在自噬 2.于對(duì)照組人膀胱組織標(biāo)本相比，我們發(fā)現(xiàn)BPS/IC病人膀胱平滑肌自噬顯著增加，但其功能并未增加。在電鏡下我們發(fā)現(xiàn)，BPS/IC病人膀胱平滑肌細(xì)胞胞中存在較多損傷的線粒體和細(xì)胞器，然而自噬小體卻未能吞噬和包裹這些損傷的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，這提示在PBS/IC病人中自噬是紊亂，這可能也是PBS/IC病人膀胱炎癥持續(xù)的重要原因。 3.我們的實(shí)驗(yàn)證明了大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞存在自噬，通過雷帕霉素增強(qiáng)大鼠平滑肌細(xì)胞自噬能顯著的降低炎癥和氧化應(yīng)激并改善膀胱功能。這提示已在臨床使用的雷帕霉素可能是一個(gè)有效的治療BPS/IC的藥物。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R694.3


本文編號(hào)：2332976