【摘要】：慢性腎臟疾病(CKD)在中國普通人群患病率高達(dá)11.8%-13.0%,與之相應(yīng),我國每年新增腎臟替代治療患者人數(shù)不斷攀升,如何延緩CKD患者腎功能進(jìn)展成為亟需解決的難題。近年研究證明脂質(zhì)異常是公認(rèn)的促進(jìn)CKD持續(xù)進(jìn)展的獨立危險因素。隨著高脂血癥發(fā)生率的增加,脂質(zhì)對腎臟的不良影響,特別是對合并CKD患者腎毒性日益受到重視。深入研究脂質(zhì)腎臟損傷的分子機(jī)制不僅可以加深對脂質(zhì)腎毒性的理論認(rèn)識,也有助于獲得防治和延緩CKD持續(xù)進(jìn)展的新思路。1982年,Moorhead提出“脂質(zhì)腎毒性”假說:腎小球病變所引起的高脂血癥和蛋白尿會導(dǎo)致腎臟疾病持續(xù)的進(jìn)展,而且脂質(zhì)的異常會同時造成動脈粥樣硬化和腎小球硬化的形成,腎小球硬化和動脈粥樣硬化是一系列相互存在聯(lián)系的臨床疾病中的一部分。我們的實驗通過體外培養(yǎng)的小鼠腎小球足細(xì)胞首次發(fā)現(xiàn),小鼠足細(xì)胞表達(dá) ROCK1,ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)刺激能調(diào)節(jié)足細(xì)胞上ROCK1的活性并使裂孔膜蛋白nephrin的表達(dá)下降。這個結(jié)果表明腎小球足細(xì)胞也許通過提高ROCK1的活性來參與脂質(zhì)腎臟損傷。但有關(guān)ox-LDL介導(dǎo)足細(xì)胞損傷的具體調(diào)控機(jī)制,尚未得到深入的研究。Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最為重要的效應(yīng)分子之一,它是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,有ROCK1和ROCK2兩個異構(gòu)體,可以被GTP結(jié)合蛋白RhoA激活(與GTP結(jié)合時被激活,與GDP結(jié)合時失活),激活的ROCK可以使其底物如肌球蛋白輕鏈、LIM激酶、埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白、肌球蛋白磷酸化亞單位(MYPT)等磷酸化,在細(xì)胞收縮、中性粒細(xì)胞遷徙、神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮極為重要的作用。有實驗表明通過抑制ROCK的表達(dá)可以增加自噬小體的體積,進(jìn)而促進(jìn)自噬的發(fā)生。另外有研究顯示在體外使用ROCK抑制劑Y-27632可以顯著增加細(xì)胞蛋白分解、減少異常蛋白質(zhì)的積聚,也可以激活細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白酶如泛素蛋白酶系統(tǒng),增加自吞噬作用,促進(jìn)細(xì)胞的異常增多的物質(zhì)的消化和分解。綜上所述,本研究是通過在體外實驗建立ox-LDL誘導(dǎo)的足細(xì)胞脂質(zhì)損傷模型,來觀察ox-LDL對小鼠足細(xì)胞ROCK1活性及nephrin表達(dá)的影響;并且通過使用ROCK1 siRNA和wt ROCK1質(zhì)粒來雙向調(diào)節(jié)ROCK1來探討ROCK1對足細(xì)胞攝取脂質(zhì)、足細(xì)胞膽固醇含量的影響以及nephrin、LC3-Ⅱ、P62、p-ULK1(Ser757)表達(dá)的關(guān)系,初步來探討ROCK1參與脂質(zhì)腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制。研究方法一、小鼠的足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定以及處理分組(一)小鼠的足細(xì)胞培養(yǎng)方法永生化條件下的足細(xì)胞(MPC)復(fù)蘇后,使用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和20-100 U/mL重組的小鼠γ干擾素在5%C02,在33℃條件下誘導(dǎo)增殖和傳代。后續(xù)轉(zhuǎn)入5%CO2,37℃培養(yǎng)箱分化等待成熟。(二)小鼠足細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察以及鑒定將33℃的培養(yǎng)箱和37℃的培養(yǎng)箱中的足細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下拍片,并觀察比較兩者之間的形態(tài)學(xué)差異;采用足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin免疫染色來確定足細(xì)胞是否已經(jīng)分化成熟了,成熟的足細(xì)胞表達(dá)并且延著細(xì)胞骨架清晰分布。(三)成熟足細(xì)胞的處理分組(1)Ox-LDL刺激對足細(xì)胞ROCK1活性影響(2)調(diào)控ROCK1的表達(dá)對p-MYPT/MYPT、nephrin等表達(dá)、足細(xì)胞攝取脂質(zhì)，細(xì)胞膽固醇濃度的影響檢測內(nèi)容使用酶法檢測足細(xì)胞膽固醇含量；Western Blot檢測p-MYPT/MYPT、Nephrin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ等的蛋白表達(dá)水平；使用免疫熒光的方法來檢測足細(xì)胞中脂質(zhì)的變化情況。四、統(tǒng)計學(xué)分析計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x=±SD)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。結(jié)果與正常對照組相比，ox-LDL刺激上調(diào)足細(xì)胞ROCK活性增加(p-MYPT表達(dá)升高)，同時伴有nephrin、LC3-Ⅱ表達(dá)下降(p0.05)，，P62、p-ULK1表達(dá)上升(P均0.05)，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加(p0.05);抑制ROCK1表達(dá)能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-MYPT水平上調(diào)，同時上調(diào)nephrin、LC3-Ⅱ的表達(dá)(p0.05),下調(diào)P62、p-ULK1的表達(dá)(p均0.05),降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量(p0.05);與之相反,增加ROCK1表達(dá)能進(jìn)一步增加ox-LDL誘導(dǎo)的p-MYPT水平,并進(jìn)一步降低nephrin、LC3-Ⅱ的表達(dá),增加P62、p-ULK1的表達(dá)(p均0.05)和細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量(p0.05)。結(jié)論ROCK1介導(dǎo)的脂質(zhì)自噬障礙是ox-LDL誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的重要途徑。
[Abstract]:Chronic kidney disease (CKD) has a high prevalence of 11. 8% to 13. 0% in the Chinese general population. In recent years, it has been shown that lipid abnormality is an independent risk factor for promoting the continuous development of CKD. With the increase of the incidence of hyperlipidemia, the adverse effects of the lipid on the kidney, especially the renal toxicity of patients with CKD, are becoming more and more important. In-depth study of the molecular mechanism of lipid kidney injury can not only deepen the theoretical understanding of the toxicity of lipid and kidney, but also help to obtain a new thought to prevent and delay the continuous development of CKD. In 1982, Moorhead proposed the 鈥渓ipoid nephrotoxicity鈥

本文編號：2317904