本文選題：草酸鈣 + 腎結(jié)石　； 參考：《復旦大學》2014年碩士論文

【摘要】：[目的]：研究不同濃度草酸鈣結(jié)晶對HK-2細胞凋亡的影響,找到合適的草酸鈣結(jié)晶濃度,以排除其對后續(xù)試驗的影響,觀察過表達VKORC1蛋白對草酸鈣結(jié)晶粘附和形成能力的影響。shRNA vkorc1,觀察VKORC 1蛋白下調(diào)對草酸鈣結(jié)晶形成能力的影響。推測VKORC 1蛋白在草酸鈣結(jié)晶形成過程中的作用,為進一步研究腎結(jié)石形成機制提供新的方向和思路。[方法]：將HK-2細胞鋪在六孔板中,與混有草酸鈣結(jié)晶的培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時,用AnnexinV/propidium iodide雙染試劑盒處理后,觀察細胞的凋亡情況。HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-7.1-VKORC1, pFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒,通過RT-PCR, Western blotting分別檢測兩組mRNA和蛋白的表達情況。在共聚焦顯微鏡下觀察并比較兩組結(jié)晶粘附和形成的差異。HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNAs 和 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC質(zhì)粒,分別在24,48,72小時行RT-PCR檢測RNA干擾的效果,篩選出干擾效果最好的質(zhì)粒。獲得穩(wěn)定的pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC穩(wěn)定細胞株,通過Western blotting來驗證pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA2和pGPU6/GFP/Neo-VKORC1 shNC組蛋白的表達情況,然后在共聚焦顯微鏡下觀察并比較兩組結(jié)晶粘附和形成的差異。[結(jié)果]：取不同濃度熒光標記草酸鈣結(jié)晶分別為：50ug/ml, 100ug/ml,400ug /ml,800ug/ml。凋亡細胞占活細胞總數(shù)的百分比：50ug/ml組為6.30±0.25；100ug/ml組為：7.0±0.64；400ug/ml組為：10.7±0.44；800ug/ml組為：17.2±0.29；mock組為：5.8±0.4。50ug/ml,100ug/ml相比于mock組沒有統(tǒng)計學意義。(P0.05),400ug/ml,800ug/ml與mock組有統(tǒng)計學意義。(P0.05)HK-2細胞分別轉(zhuǎn)染pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1和pFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒,分別取24,48小時兩個時間點,行RT-PCR實驗得知：pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1組mRNA的表達量與pFLAG-CMV-7.1相比有顯著差異。(P0.001)。Western blotting驗證實驗組VKORC 1蛋白的表達量高于對照組。將轉(zhuǎn)染的pCMV-7.1-VKORC 1和pFLAG-CMV-7.1質(zhì)粒的HK-2細胞,與混有草酸鈣結(jié)晶的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48小時,通過激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)晶形成情況,在100倍視野下觀察結(jié)晶形成數(shù)目,pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1組為：14±4;pFLAG-CMV-7.1為：26±4。實驗組結(jié)晶形成能力比對照組相比有統(tǒng)計學意義。(P0.05),分別轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNAs和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC質(zhì)粒,取三個時間點24,48,72小時來檢測mRNA,我們發(fā)現(xiàn)pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA2明顯抑制VKORC1 mRNA的表達。篩選穩(wěn)定細胞株,通過激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)晶形成情況,在100倍視野下結(jié)晶形成數(shù)目,干擾組為：65+11,NC組為：24+8,干擾組比pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC組有統(tǒng)計學意義。(P0.05)。[結(jié)論]：低濃度的草酸鈣結(jié)晶對腎小管細胞的凋亡影響相較于對照組沒有明顯的差異。高于400ug/ml草酸鈣鹽結(jié)晶才會對腎小管細胞產(chǎn)生損傷。通過過表達和下調(diào)VKORC1的表達,發(fā)現(xiàn)VKORC1有抑制草酸鈣鹽結(jié)晶粘附和聚集的作用。本研究為了解結(jié)晶和上皮細胞的相互作用、結(jié)晶的形成機制提供了新的方法和思路。
[Abstract]:[Objective] to study the effect of calcium oxalate crystallization on HK-2 cell apoptosis in different concentrations and find the appropriate concentration of calcium oxalate crystal to exclude the effect on the follow-up test, and observe the effect of VKORC1 protein on the adhesion and formation of calcium oxalate crystallization and the formation ability of.ShRNA VKORC1, and observe the effect of VKORC 1 protein down on the crystallization of calcium oxalate. The effect of VKORC 1 protein in the crystallization of calcium oxalate can provide new directions and ideas for further study of the mechanism of kidney stone formation. [method]: the HK-2 cells were spread in the six pore plate and cultured with calcium oxalate crystals for 48 hours, and the cell withering was observed with the AnnexinV/propidium iodide double staining kit. .HK-2 cells were transfected with pFLAG-CMV-7.1-VKORC1 and pFLAG-CMV-7.1 plasmid respectively. The expression of mRNA and protein in two groups was detected by RT-PCR and Western blotting respectively. The difference of.HK-2 cells from the two groups was observed and compared to pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNAs and pGPU6/GFP/Neo-shR by the confocal microscopy. NA-NC plasmid, the effect of RNA interference was detected by RT-PCR at 24,48,72 hours respectively, and the plasmid with the best interference effect was screened. Stable pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA and pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC stable cell lines were obtained, and Western blotting was used to verify the expression of pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA2 and pGPU6/GFP/Neo-VKORC1 histones. And then observed and compared the differences between the two groups of adhesion and formation under confocal microscopy. [results]: the crystallization of calcium oxalate with different concentrations was 50ug/ml, 100ug/ml, 400ug /ml, and the percentage of 800ug/ml. apoptotic cells accounted for the total number of living cells: 50ug/ml group was 6.30 + 0.25; 100ug/ml group was 7 + 0.64; 400ug/ml group. 10.7 + 0.44, group 800ug/ml was 17.2 + 0.29, group mock was 5.8 + 0.4.50ug/ml, 100ug/ml was not statistically significant compared with mock group. (P0.05), 400ug/ml, 800ug/ml and mock group had statistical significance. (P0.05) HK-2 cells were transfected respectively for pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1 and plasmid, respectively, for two hours, respectively. The experimental results showed that the expression of mRNA in pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1 groups was significantly different from that of pFLAG-CMV-7.1. (P0.001) the expression of VKORC 1 protein in the.Western blotting test group was higher than that of the control group. The transfected pCMV-7.1-VKORC 1 and pFLAG-CMV-7.1 plasmids HK-2 cells were co cultured with the culture medium with calcium oxalate crystallization for 48 hours. The formation of crystallization was observed by laser confocal microscopy, and the number of crystal formation was observed at 100 times of visual field. The pFLAG-CMV-7.1-VKORC 1 groups were 14 + 4, and pFLAG-CMV-7.1 was: the crystallization ability of the 26 + 4. experimental group was statistically significant compared with the control group. (P0.05), pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNAs and pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC plasmids were transfected respectively. Taking three time points for 24,48,72 hours to detect mRNA, we found that pGPU6/GFP/Neo-VKORC 1 shRNA2 significantly inhibited the expression of VKORC1 mRNA. The stable cell lines were screened and the crystallization formation was observed by laser confocal microscopy, and the number of crystals formed under 100 times of visual field. The interference group was 65+11, NC group was 24+8, and the interference group was more than pGPU6/GFP/Neo-sh. RNA-NC group had statistical significance (P0.05). [Conclusion]: the effect of low concentration calcium oxalate crystallization on renal tubular cell apoptosis was not significantly different from that of the control group. Higher than the 400ug/ml calcium oxalate crystallization of 400ug/ml could damage the renal tubule cells. Through overexpression and down regulation of VKORC1 expression, it was found that VKORC1 inhibited calcium oxalate crystallization. This study provides new methods and ideas for understanding the interaction between crystallization and epithelial cells and the formation mechanism of crystallization.
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R691.4

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本文編號：2084965