本文選題：HDAC + Hippo��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,hHcys)是終末期腎病進展過程中的一個關(guān)鍵獨立致病因子,這一點已非常明確,但hHcys致腎臟損傷的病理生理學(xué)機制仍須深一步研究。近年來,表觀遺傳學(xué)在腎臟疾病中的研究受到越來越多的關(guān)注,組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙�；�(HDAC)對于組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化水平的調(diào)控是其重要內(nèi)容之一。HDAC共分為四類18個亞型:Ⅰ類(ClassⅠ)為Rpd3 樣蛋白,包括HDAC1,HDAC2,HDAC3,HDAC8;Ⅱ類(ClassⅡ)為Hdal 樣蛋白,又分Ⅱa類即HDAC4,HDAC5,HDAC7,HDAC9 和Ⅱb類即HDAC6,HDAC10;Ⅲ類(ClassⅢ)為Ser2 樣蛋白,包括SIRT1-7;Ⅳ類(ClassⅣ)為HDAC11。ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ為Zn2+依賴型,Class Ⅲ為NAD+依賴型。越來越多的證據(jù)也表明HDAC可調(diào)控非組蛋白的去乙�；ｋm然,廣譜類HDAC抑制劑在腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,但其缺點也非常明顯,如缺乏對HDAC亞型的特異性作用,進而引起的副作用也比較嚴(yán)重。并且,有研究發(fā)現(xiàn)HDAC參與到了腎臟纖維化進程中,雖然其所介導(dǎo)的腎臟纖維化機制并不十分清楚,可能與調(diào)節(jié)炎性因子、促纖維化因子的表達和激活介導(dǎo)腎臟纖維化信號通路有關(guān)。因此,在hHcys致腎臟損傷中,何種亞型HDAC起到作用及其機制有待明確和探討。研究表明,Hippo信號通路與腎臟損傷有著密切的聯(lián)系,參與腎臟纖維化等過程。為此,本課題將研究HDAC在hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用,并進一步闡明Hippo信號通路是否參與相關(guān)調(diào)控。實驗方法與結(jié)果1.HDAC在hHCys模型動物腎臟中的表達對C57BL/6J野生雄性小鼠(10周齡)摘除單腎,一周后隨機分為兩組,采用不含葉酸的飼料喂養(yǎng)8周來構(gòu)建hHcys動物模型,喂養(yǎng)正常飼料組作為對照。高效液相色譜法檢測不含葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸含量升高,證明hHcys模型構(gòu)建成功。送檢尿液樣品中尿白蛋白/肌酐比值升高。過碘酸-雪夫染色方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色和透射電鏡的方法觀察足細胞損傷,結(jié)果顯示hHcys小鼠腎臟中出現(xiàn)明顯的系膜基質(zhì)增生,基底膜增厚,足突融合,表明腎小球存在損傷;Masson染色方法對小鼠腎臟石蠟切片進行染色,hHcys模型腎臟中出現(xiàn)纖維化病變,提示腎臟功能障礙,腎小管出現(xiàn)損傷。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),11個HDAC亞型中HDAC9表達升高最為明顯。通過蛋白免疫印跡免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光雙重標(biāo)記檢測HDAC9在腎臟中表達變化和分布,相比其他部分Zn2+依賴型HDAC,HDAC9在hHcys模型小鼠腎臟皮質(zhì)中表達上調(diào)最為明顯,在足細胞、遠曲小管和集合管中均表達升高。通過L型同型半胱氨酸刺激足細胞和腎小管上皮細胞,結(jié)果顯示HDCA9呈現(xiàn)劑量依賴性升高。2.HDAC9在hHcys致腎臟損傷中的作用及機制HDAC9基因沉默大鼠模型構(gòu)建采用大鼠腎臟局部注射重組的包備有shRNA-HDAC9的慢病毒載體pGLV3/H 1/GFPtPuro(pGLV3)介導(dǎo)大鼠腎臟HDAC9基因沉默,二十只SD雄性大鼠隨機平均分為四組,構(gòu)建hHcys動物模型。IF實驗結(jié)果顯示,慢病毒攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)廣泛表達,并且與足細胞標(biāo)志物synaptopodin和集合管標(biāo)志物AQP3共定位。進行Masson染色分析,結(jié)果顯示,HDCA9沉默減輕高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟纖維化。PAS染色結(jié)果說明,腎小球基底膜的增厚和系膜增生能一定程度上被HDAC9沉默所緩解。體內(nèi)實驗IF、IHC和體外實驗WB結(jié)果顯示由hHcys所介導(dǎo)的足細胞裂孔隔膜相關(guān)蛋白nephrin表達下調(diào)和正常結(jié)構(gòu)形態(tài)的破壞能夠一定程度上被HDAC9的沉默所逆轉(zhuǎn),并且纖維連接蛋白fibronectin這一促纖維化因子在hHcys介導(dǎo)下的高表達能夠一定程度上被HDAC9的沉默所抑制。hHcys模型大鼠腎臟中,Hippo核心蛋白YAP表達上調(diào),可被HDAC9沉默所抑制。體外實驗中,L-Hcys能夠誘導(dǎo)HK-2細胞中YAP的表達上調(diào),基因沉默HDA9可以阻斷YAP對Hcys的應(yīng)答,并且下游Smad2、Smad3的活性也被抑制,表明HDAC9可能通過YAP-Smad2/3信號通路來促進hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷。結(jié)論與創(chuàng)新性1.本研究次發(fā)現(xiàn)HDAC9在hHcys模型小鼠和大鼠腎臟中顯著升高,并且在HK-2和HPC細胞中,HDAC9呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴性升高�；虺聊琀DAC9減輕了 hHcys介導(dǎo)的腎小球損傷、裂孔隔膜相關(guān)蛋白的表達下調(diào)和結(jié)構(gòu)破、促纖維化因子的高表達從而減輕足細胞損傷和腎臟纖維化,表明HDAC9在hHcys致腎臟損傷中起到重要的作用。2.本研究首次發(fā)現(xiàn)HDAC9促進腎臟損傷的作用可能與其參與調(diào)控Hippo信號通路有關(guān)。該研究對于高同型半胱氨酸血癥致腎臟損傷的病理生理學(xué)機制有了更深入的認(rèn)識,并為HDAC9作為靶點治療腎臟纖維化相關(guān)疾病提供一定的理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , the mechanism of HDAC plays an important role in the pathogenesis of renal fibrosis . In vitro experiments , the expression of HDAC9 in renal cortex of rat kidney was significantly increased . The results showed that the expression of HDAC9 in renal cortex of human kidney was higher than that of other parts Zn2 + - dependent HDAC and HDAC9 .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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本文編號：2044368