本文選題：前列腺癌　切入點(diǎn)：AGR2　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是嚴(yán)重威脅中老年男性生命健康的惡性腫瘤,在北美其死亡率僅次于肺癌。隨著人口老齡化、生活環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的改變等,我國(guó)PCa發(fā)病率迅猛增長(zhǎng),且中晚期患者的比例遠(yuǎn)大于國(guó)外,死亡率在亞洲國(guó)家僅次于越南,位居第二。由于PCa惡性程度高,臨床缺乏有效的治療方案,預(yù)后差,因此針對(duì)其惡性表型的機(jī)制及其治療策略的研究一直倍受關(guān)注。作為一種激素依賴性腫瘤,PCa的臨床首選方案是內(nèi)分泌治療。但絕大多數(shù)PCa患者在接受治療后1-2年,腫瘤復(fù)發(fā)并發(fā)展成為抵抗內(nèi)分泌治療且伴隨遠(yuǎn)端侵襲轉(zhuǎn)移的去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer, CRPC)�；熓桥R床上應(yīng)對(duì)CRPC的主要手段：除米托蒽醌、磷雌氮芥等,微管靶向藥物多西紫杉醇(Docetaxel, Doc)、卡巴他賽(Cabazitaxel)也是一線治療方案的常用藥物,此類藥物作為天然產(chǎn)物紫杉烷的衍生物,已被證實(shí)是目前唯一能夠有效延長(zhǎng)PCa患者生存期的化療藥。但統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,有50%左右的CRPC患者對(duì)多西紫杉醇先天不敏感、產(chǎn)生耐受,或者經(jīng)藥物治療后產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用；同時(shí),與其它抗腫瘤藥物相類似,經(jīng)多西紫杉醇治療后會(huì)誘發(fā)腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR),導(dǎo)致化療失敗。多西紫杉醇誘導(dǎo)的MDR機(jī)制比較復(fù)雜,主要包括：藥泵蛋白如P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)過(guò)度表達(dá)、微管結(jié)構(gòu)功能改變、凋亡機(jī)制變化、MicoRNA的調(diào)節(jié)作用、耐藥細(xì)胞株上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)等。針對(duì)多西紫杉醇MDR的逆轉(zhuǎn)策略也在積極的探索,多有報(bào)道,如卡巴他賽對(duì)P-gp的親和力較低,可作為經(jīng)多西紫杉醇治療后P-gp介導(dǎo)的MDR逆轉(zhuǎn)劑,取得了良好的臨床效果。但PCa的MDR是多信號(hào)、多基因并存的機(jī)制,單一耐藥靶點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)依然具有局限性,因此深入分析PCa惡性表型的發(fā)生機(jī)制、尋找新的治療策略仍刻不容緩。本課題組前期基于癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCG A)計(jì)劃所提供的基因組測(cè)序數(shù)據(jù),分析與CRPC的分期、侵襲轉(zhuǎn)移、藥物耐受等惡性表型密切相關(guān)的基因,篩選出前梯度同源蛋白2(Anterior gradient protein 2 homolog, AGR2)為候選基因之一。AGR2與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均密切相關(guān),研究報(bào)道較多。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)AGR2在中國(guó)漢族人群前列腺癌病人癌組織中高表達(dá),其高表達(dá)量與病人低生存率密切相關(guān)。并且AGR2下調(diào)可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞衰老,而衰老也與腫瘤的發(fā)生和耐藥等過(guò)程有關(guān)。近年來(lái),AGR2與腫瘤耐藥的關(guān)聯(lián)研究初露端倪：AGR2高表達(dá)能夠增強(qiáng)乳腺癌、胰腺癌、法特壺腹癌、肺癌對(duì)順鉑、多柔比星及吉西他濱等傳統(tǒng)化療藥物的耐受；雌激素拮抗劑他莫昔芬可誘導(dǎo)乳腺癌AGR2高表達(dá),從而抵抗他莫昔芬治療而產(chǎn)生耐藥。與上述腫瘤不同,內(nèi)分泌治療失敗的CRPC患者血清AGR2的水平與激素敏感性前列腺癌患者相比較低,激素非依賴性前列腺癌耐紫杉醇細(xì)胞株(PC3-Rx)中AGR2的表達(dá)顯著下調(diào)；而干擾PC3細(xì)胞中AGR2的表達(dá),會(huì)增加其對(duì)紫杉醇的耐受。上述結(jié)果顯示,AGR2表達(dá)下調(diào)與前列腺癌細(xì)胞的紫杉醇耐藥有關(guān),但機(jī)制尚不明確。同時(shí)我們利用多西紫杉醇誘導(dǎo)PCa細(xì)胞PC3(惡性程度高、且激素非依賴型的PCa細(xì)胞),構(gòu)建多藥耐藥細(xì)胞PC3/Doc,通過(guò)分析PC3／Doc細(xì)胞基因表達(dá)差異譜芯片數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)AGR2表達(dá)下調(diào)顯著。因此,本論文將繼續(xù)分析AGR2在PCa惡性表型中的作用,重點(diǎn)分析AGR2與PCa的侵襲轉(zhuǎn)移、多藥耐藥的關(guān)系：1)多西紫杉醇下調(diào)AGR2的機(jī)制；2) AGR2下調(diào)與PCa的MDR相關(guān)性及其應(yīng)對(duì)策略；3)AGR2促進(jìn)PCa侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制；4)鑒于多西紫杉醇屬二萜化合物,我們同樣對(duì)新的貝殼杉烷型二萜類天然化合物進(jìn)行抗腫瘤活性篩選,并分析AGR2對(duì)新的活性二萜化合物的應(yīng)答,以期發(fā)現(xiàn)能夠逆轉(zhuǎn)AGR2介導(dǎo)的MDR的新化合物,為新藥研發(fā)開闊思路。第一部分AGR2表達(dá)下調(diào)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇耐藥及逆轉(zhuǎn)劑研究我們通過(guò)生物信息學(xué)分析AGR2參與或介導(dǎo)的生物學(xué)功能,結(jié)果顯示,除作用細(xì)胞周期與增殖等信號(hào)外,泛素-蛋白酶體通路與其相關(guān)性最高。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome syste, UPS)是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系之一。UPS通過(guò)將小分子蛋白泛素與靶蛋白的賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合,使靶蛋白泛素化。泛素標(biāo)記的蛋白可以被蛋白酶體特異性識(shí)別并被迅速降解。蛋白酶體(Proteasome)是一種龐大的多種蛋白和酶組成的復(fù)合酶,在周期運(yùn)轉(zhuǎn)、凋亡與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用。惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝旺盛,會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的錯(cuò)誤折疊蛋白、待降解蛋白等,蛋白酶體活性升高,腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑更加敏感,因此,蛋白酶體也成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。鑒于紫杉醇類藥物在前列腺癌治療中具有重要作用,而其誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDR細(xì)胞中AGR2表達(dá)水平下調(diào)。我們首先分析多西紫杉醇如何下調(diào)AGR2,并確定AGR2下調(diào)是否介導(dǎo)前列腺癌對(duì)多西紫杉醇的耐受。更為重要的是,我們根據(jù)生物信息學(xué)的分析結(jié)果提出假設(shè),AGR2影響泛素-蛋白酶體信號(hào),蛋白酶體活性參與AGR2介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞耐藥,蛋白酶體抑制劑可用于逆轉(zhuǎn)上述AGR2下調(diào)介導(dǎo)的耐藥。一、多西紫杉醇通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)AGR2的蛋白降解1.多西紫杉醇下調(diào)AGR2的表達(dá)：前列腺癌細(xì)胞PC3經(jīng)多西紫杉醇處理后,細(xì)胞內(nèi)AGR2的蛋白水平隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)降低。2.多西紫杉醇誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞及化療后病人血樣中AGR2的表達(dá)顯著降低：Western blotting結(jié)果表明：多西紫杉醇誘導(dǎo)的多藥耐藥PC3／Doc細(xì)胞株中AGR2的表達(dá)下調(diào)；而紫杉醇誘導(dǎo)的多藥耐藥肺癌細(xì)胞H460/RT中AGR2 的表達(dá)也顯著下調(diào)。另外,通過(guò)異種移植小鼠荷瘤模型經(jīng)多西紫杉醇治療后的瘤組織中AGR2的表達(dá)也呈顯著下調(diào)趨勢(shì)。更為重要的一點(diǎn)是,通過(guò)ELISA分析非小細(xì)胞肺癌患者化療前后血清中AGR2的表達(dá)水平,結(jié)果表明,化療后患者血清中的AGR2含量顯著降低。3.多西紫杉醇通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)AGR2的降解從而降低AGR2水平：前期研究表明,紫杉醇可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性自噬。我們首先通過(guò)免疫熒光確定多西紫杉醇可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞發(fā)生自噬,結(jié)果表明自噬的標(biāo)志物蛋白LC3的熒光強(qiáng)度增加并呈斑點(diǎn)聚集,具有時(shí)間依賴性,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)AGR2的表達(dá)下降。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：伴隨多西紫杉醇作用時(shí)間的延長(zhǎng),AGR2水平下調(diào),而LC3Ⅱ/Ⅰ比率增大,自噬底物p62與CALCOCO2顯著降低,表明多西紫杉醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,自噬產(chǎn)生的同時(shí)伴隨著AGR2表達(dá)的降低。進(jìn)一步分析顯示,在PC3細(xì)胞中通過(guò)RNAi沉默LC3表達(dá),可逆轉(zhuǎn)多西紫杉醇下調(diào)AGR2的作用。同時(shí)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),多西紫杉醇可使AGR2泛素化水平增高,提示泛素化的AGR2可通過(guò)自噬降解。二、低表達(dá)AGR2降低細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性1.PC3細(xì)胞下調(diào)AGR2產(chǎn)生耐藥：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在AGR2表達(dá)較高的PC3細(xì)胞中下調(diào)AGR2,與對(duì)照細(xì)胞相比,AGR2下調(diào)后PC3細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性降低。與之相反,在AGR2表達(dá)較低的RWPE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AGR2,細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性則會(huì)增加。2.穩(wěn)定低敲AGR2降低細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的敏感性：我們利用慢病毒感染PC3細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定敲低AGR2細(xì)胞株P(guān)C3/KD,并分析其對(duì)藥物的敏感性。MTT結(jié)果表明穩(wěn)敲AGR2細(xì)胞株對(duì)多西紫杉醇的敏感性下降,產(chǎn)生耐受。三、AGR2抑制蛋白酶體活性對(duì)與AGR2表達(dá)相關(guān)的基因進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)AGR2與蛋白泛素-蛋白酶體通路的相關(guān)性最高。1.AGR2可負(fù)調(diào)控蛋白酶體活性：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),RWPE1細(xì)胞高表達(dá)AGR2后能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶(ChT-L)和肽基谷氨酰多肽解酶(PGPH)的活性,但不影響胰蛋白酶活性。在PC3細(xì)胞干擾AGR2、下調(diào)其表達(dá)后ChT-L和PGPH活性增強(qiáng)。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AGR2低表達(dá)或高表達(dá)時(shí),細(xì)胞蛋白的總泛素化水平相應(yīng)地分別降低或升高。同樣,在耐藥細(xì)胞中由于AGR2水平下調(diào),細(xì)胞總蛋白泛素化水平也呈下降趨勢(shì)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AGR2負(fù)調(diào)節(jié)蛋白酶體活性：通過(guò)裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn),利用免疫組化和western blotting技術(shù),發(fā)現(xiàn)AGR2低表達(dá)的動(dòng)物瘤組織中蛋白的總泛素化水平降低,表明其蛋白酶體活性升高從而促進(jìn)泛素化蛋白的降解。同時(shí),通過(guò)測(cè)定瘤組織蛋白酶體活性發(fā)現(xiàn),低表達(dá)AGR2組瘤組織蛋白酶ChT-L和PGPH體活性顯著增加,與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所不同,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,AGR2低表達(dá)組中胰蛋白酶活性也同樣增加。四、蛋白酶體抑制劑逆轉(zhuǎn)AGR2低表達(dá)產(chǎn)生的耐藥1. AGR2低表達(dá)增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性：下調(diào)PC3細(xì)胞內(nèi)AGR2的表達(dá),可增強(qiáng)該細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑Bortezomib的敏感性；相反,細(xì)胞中AGR2的表達(dá)升高可降低其對(duì)Bortezomib的敏感性,引起耐受。穩(wěn)定敲低的PC3/KD細(xì)胞也同樣顯示出對(duì)Bortezomib的敏感性增強(qiáng)。2.裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在經(jīng)過(guò)4次化療給藥后,AGR2低表達(dá)組對(duì)多西紫杉醇敏感性低于對(duì)照組；與之相反,AGR2低表達(dá)組對(duì)Bortezomib產(chǎn)生良好的應(yīng)答,其抑瘤效果顯著高于對(duì)照組。免疫組化結(jié)果顯示,AGR2低表達(dá)組經(jīng)Bortezomib治療后,細(xì)胞增殖的標(biāo)志物蛋白ki67染色顯著弱于對(duì)照組,表明其良好的抗腫瘤活性；而多西紫杉醇的藥效要低于Bortezomib。綜上,AGR2低表達(dá)介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇耐受,而利用其對(duì)蛋白酶體活性的負(fù)調(diào)控特點(diǎn),可使用蛋白酶體抑制劑逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇的耐受。第二部分AGR2促進(jìn)血管新生與誘導(dǎo)EMT而增強(qiáng)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥都是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征,除多藥耐藥,遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移也是CRPC患者死亡的主要因素。多篇文獻(xiàn)報(bào)道AGR2促進(jìn)前列腺癌、口腔上皮癌、胰腺癌、甲狀腺癌、肺腺癌等多種腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生,但其機(jī)制研究尚不完全清楚。本論文就AGR2促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究,從而為AGR2作為前列腺癌治療的靶點(diǎn)提供更充分的依據(jù)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均依賴于充足的營(yíng)養(yǎng)供給,腫瘤組織中血管的形成為氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞、代謝產(chǎn)物運(yùn)出細(xì)胞外以及腫瘤細(xì)胞遷移至靶器官等活動(dòng)提供了重要保障。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR2受體激活下游信號(hào)通路,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和管狀形成,促進(jìn)新生血管形成,提高血管通透性,滿足腫瘤細(xì)胞對(duì)氧和營(yíng)養(yǎng)的需求,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)作為多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育時(shí)重要的基礎(chǔ)過(guò)程,同時(shí)存在于多種慢性疾病(如腎纖維化)和腫瘤的發(fā)展過(guò)程中。它描述的是上皮細(xì)胞經(jīng)歷短暫的結(jié)構(gòu)改變,同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生變化,在此過(guò)程中,上皮細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)極性與細(xì)胞骨架均發(fā)生改變,從而使上皮細(xì)胞的變形遷移能力和運(yùn)動(dòng)能力提高,抗凋亡能力增強(qiáng),因此在腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移時(shí)扮演著重要角色。EMT發(fā)生過(guò)程中,上皮細(xì)胞分子marker如E-鈣黏素角蛋白(E-Cadherin)等上皮標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)和N-鈣黏素(N-Cadherin)與波形蛋白(Vimentin)等間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)。多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、蛋白酶、細(xì)胞信號(hào)通路等均可通過(guò)調(diào)控某些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、 Slug、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2、Foxc1、Foxc2、NF-κB等誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)AGR2可通過(guò)上調(diào)VEGFR2表達(dá)促進(jìn)血管新生,同時(shí)可以抑制p65降解,誘導(dǎo)EMT發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。一、AGR2促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明AGR2促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移：我們通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)分析AGR2對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示,在AGR2表達(dá)水平較高的PC3細(xì)胞中干擾AGR2表達(dá)后,穿過(guò)Migration小室的細(xì)胞數(shù)目減少約50%,劃痕的愈合程度顯著小于其對(duì)照組。而在RWPE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AGR2后,穿過(guò)Migration小室的細(xì)胞數(shù)目顯著增加,劃痕愈合的程度明顯增加。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AGR2促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移：通過(guò)裸鼠原位種植以及活體動(dòng)物成像技術(shù),我們分析AGR2表達(dá)升高對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示,前列腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AGR2,顯著促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng),而且腫瘤細(xì)胞向肝臟、腋下及頸部轉(zhuǎn)移,表明AGR2增強(qiáng)前列腺癌向遠(yuǎn)端的軟組織轉(zhuǎn)移能力。二、AGR2通過(guò)上調(diào)VEGFR2表達(dá),激活VEGF通路促進(jìn)血管新生而促進(jìn)前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移1.AGR2促進(jìn)瘤組織血管生成：通過(guò)觀察、對(duì)比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)瘤組織發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)AGR2的瘤塊組織較對(duì)照組血管豐富,顏色鮮紅,提示AGR2可能具有促進(jìn)血管新生的作用。免疫組化結(jié)果顯示,高表達(dá)AGR2的瘤塊組織血管新生指標(biāo)CD34、VEGFR2表達(dá)顯著高于對(duì)照組。2. AGR2增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生與遷移能力：血管新生實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中加入293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染AGR2質(zhì)粒后產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基,小管形成數(shù)量顯著多于對(duì)照組。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,分泌至培養(yǎng)基中的AGR2能夠促進(jìn)HUVEC細(xì)胞穿過(guò)小室,增強(qiáng)該細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。3. AGR2激活VEGFR-AKT信號(hào)：由于AGR2具有促進(jìn)血管新生、細(xì)胞增殖與遷移的作用,我們隨后檢測(cè)與之相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)鍵因子的變化。Western blotting結(jié)果顯示,高表達(dá)AGR2后,乏氧誘導(dǎo)因子HIF-α表達(dá)增加,ERK、PI3K/AKT磷酸化水平升高。而下調(diào)PC3細(xì)胞中的AGI R2,會(huì)明顯抑制HIF-a與VEGFR2的表達(dá),同時(shí)下游PI3K/AKT的磷酸化水平降低,表明經(jīng)典的信號(hào)通路參與AGR2-VEGFR2介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。三、AGR2通過(guò)抑制蛋白酶體活性、減少p65降解而促進(jìn)EMT的發(fā)生AGR2與EMT的關(guān)系已有報(bào)道,但有不同的結(jié)論：Ma SR與Xu C分別報(bào)道AGR2可促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤EMT的發(fā)生,而Mizuuchi報(bào)道下調(diào)AGR2后不影響胰腺島管腺癌EMT的發(fā)生。我們?cè)谶^(guò)表達(dá)AGR2后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有明顯的形態(tài)變化,上皮細(xì)胞的特征減少,而間質(zhì)細(xì)胞的特征增加,表明AGR2可能促進(jìn)前列腺癌的EMT發(fā)生而參與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。1. AGR2促進(jìn)EMT的發(fā)生：光鏡結(jié)果顯示,干擾前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3中AGR2的表達(dá)后,細(xì)胞由分散生長(zhǎng)趨向聚集生長(zhǎng),且細(xì)胞形態(tài)由較為細(xì)長(zhǎng)的梭形轉(zhuǎn)向多邊形；而在RWPE1細(xì)胞中增加AGR2表達(dá)后,細(xì)胞形態(tài)變成細(xì)長(zhǎng)梭形,且細(xì)胞分散生長(zhǎng),表明AGR2可影響細(xì)胞的極性,促進(jìn)上皮向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。Western blotting與免疫熒光結(jié)果顯示,下調(diào)PC3細(xì)胞中AGR2的表達(dá),上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)增加,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)減少,調(diào)控EMT發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子slug表達(dá)減少。定量PCR結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中下調(diào)AGR2后,E-Cadherin、Claudin1顯著上調(diào),Vimentin減少顯著,但N-Cadherin變化不明顯。高表達(dá)AGR2后可下調(diào)蛋白E-Cadherin表達(dá),上調(diào)Vimentin表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了AGR2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生。2. AGR2通過(guò)抑制蛋白酶體活性、減少p65的降解而促進(jìn)EMT的發(fā)生：由于AGR2可抑制蛋白酶體活性,而NF-κB作為其重要的下游因子,可通過(guò)調(diào)控靶基因如基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞遷移,我們通過(guò)免疫熒光、western blotting以及qRT-PCR分析AGR2對(duì)NF-κB的亞基之一p65的影響。結(jié)果顯示,AGR2可在蛋白水平而非轉(zhuǎn)錄階段促進(jìn)p65的表達(dá),同時(shí)能夠促進(jìn)其下游基質(zhì)金屬蛋白酶MMP16、MMP2與MMP9的表達(dá)。由于AGR2可以抑制蛋白酶體活性,在PCa細(xì)胞中加入蛋白合成抑制劑放線菌酮后,發(fā)現(xiàn)AGR2可延長(zhǎng)p65半衰期,表明AGR2可降低p65的蛋白降解。為了進(jìn)一步確定AGR2的作用是通過(guò)NF-κB介導(dǎo)的,我們?cè)赑C3細(xì)胞株中下調(diào)p65的表達(dá),western blotting結(jié)果顯示E-Cadherin、TCF8、MMP16表達(dá)增加,而Vimentin表達(dá)降低,表明在p65缺失的情況下,可部分逆轉(zhuǎn)AGR2促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的作用。同時(shí)我們利用RWPE1細(xì)胞進(jìn)一步分析p65在AGR2促侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)p65后上皮細(xì)胞的marker蛋白E-Cadherin表達(dá)降低,而Vimentin無(wú)顯著變化,同時(shí)MMP16表達(dá)增加,證實(shí)了p65的重要性。我們也利用免疫熒光檢測(cè)AGR2對(duì)p65表達(dá)的影響,PC3細(xì)胞中下調(diào)AGR2后,p65的熒光強(qiáng)度顯著減弱,而在RWPE1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AG2導(dǎo)致p65的熒光增強(qiáng),表明AGR2可正調(diào)控p65的表達(dá)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。第三部分AGR2對(duì)新型貝殼杉烷型二萜化合物的應(yīng)答及化合物抗腫瘤活性分析CRPC的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,而經(jīng)一線化療藥物多西紫杉醇治療后,會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥。本論文的研究結(jié)果顯示,經(jīng)多西紫杉醇治療后AGR2表達(dá)下調(diào),而低水平的AGR2引起前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西紫杉醇耐藥。從天然資源中尋求高效低毒抗腫瘤藥物是新藥研發(fā)的重要策略,如多西紫杉醇即為二萜生物堿化合物。我們從苔蘚植物片葉葉苔中分離得到了一類新的貝殼杉烷型二萜化合物Jungermannenones A (JA)、Jungermannenones B (JB),除了關(guān)注其抗腫瘤活性外,我們首先確定該類化合物是否影響AGR2的表達(dá),是否與多西紫杉醇對(duì)AGR2的影響有所不同而成為新的潛力化合物。一、JA和JB促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡1.JA和JB抑制前列腺癌細(xì)胞PC3增殖。MTT結(jié)果顯示JA和JB對(duì)多種腫瘤細(xì)胞殺傷活性較高,且對(duì)永生化正常前列腺上皮細(xì)胞毒性低于腫瘤細(xì)胞。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)曲線顯示JA和JB對(duì)PC3細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用,且作用強(qiáng)度呈濃度時(shí)間依賴性。2.JA和JB促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。流式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明JA和JB呈時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡,且JA誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間早于JB。Western blotting結(jié)果表明,JA和JB可通過(guò)激活caspsae3誘導(dǎo)凋亡。Caspase抑制劑z-VAD-fmk能夠逆轉(zhuǎn)JA和JB誘導(dǎo)的絕大多數(shù)PC3細(xì)胞的死亡。二、AGR2對(duì)貝殼杉烷型二萜化合物的應(yīng)答1.化合物JA和JB對(duì)AGR2表達(dá)的影響：western blotting結(jié)果顯示化合物JA作用PCa細(xì)胞PC32h時(shí),AGR2表達(dá)開始出現(xiàn)下調(diào),并隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),AGR2表達(dá)持續(xù)降低；而化合物JB,對(duì)AGR2蛋白的表達(dá)下調(diào)作用不顯著；但是兩個(gè)化合物都可顯著降低PC3細(xì)胞中MMP16的蛋白含量,增加E-Cadherin的表達(dá),呈時(shí)間依賴性。2.化合物JA和JB能抑制PC3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力：劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物JA和JB均能夠抑制劃痕的愈合,且抑制作用呈濃度依賴性；Transwell實(shí)驗(yàn)顯示化合物JA和JB均可抑制PC3細(xì)胞穿過(guò)Migration小室的能力。表明化合物JA仍然具有誘導(dǎo)多藥耐藥的可能性,而化合物JB對(duì)AGR2影響不顯著,可以進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾改造,以期降低毒性,增加療效。三、JA和JB增加ROS誘導(dǎo)PC3細(xì)胞DNA與線粒體損傷1.化合物JA減少PC3細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘與總谷胱甘肽的含量,且呈時(shí)間依賴性。應(yīng)用巰基探針利用免疫熒光技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)化合物JA和JB均能減少PCa細(xì)胞株P(guān)C3和DU145細(xì)胞內(nèi)游離巰基的含量。2.JA和JB誘導(dǎo)PC3細(xì)胞產(chǎn)生ROS。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用JA處理PC3細(xì)胞2h后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平達(dá)到峰值,且一直維持較高水平,而用JB處理PC3細(xì)胞2h后ROS細(xì)胞內(nèi)聚集達(dá)到頂峰,持續(xù)到12h,24h后減少。加入還原劑Vitamin C可逆轉(zhuǎn)化合物誘導(dǎo)ROS作用。MTT結(jié)果顯示Vitamin C可部分逆轉(zhuǎn)JA和JB誘導(dǎo)PC3細(xì)胞的凋亡作用,JA對(duì)PC3細(xì)胞的抑制率自50.14%降至13.65%,而JB的逆轉(zhuǎn)作用稍弱,由52.64%降至31.98%。3.JA和JB導(dǎo)致PC3細(xì)胞線粒體損傷。透射電鏡結(jié)果明確顯示,JA和JB使PC3細(xì)胞中線粒體隨作用時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生腫脹、內(nèi)膜出現(xiàn)斷裂重組髓樣化、線粒體灶性聚集、與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離等。4.JA和JB誘導(dǎo)PC3細(xì)胞I)NA損傷。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),JA和JB都能導(dǎo)致PC3細(xì)胞出現(xiàn)顯著的DNA損傷,且呈時(shí)間依賴性, JA在作用4h后明顯誘導(dǎo)損傷,JB需要作用8h才引起PC3細(xì)胞較明顯的損傷。Western blotting顯示JA和JB均可誘導(dǎo)DNA損傷標(biāo)志蛋白yH2AX表達(dá)上調(diào),激活DNA損傷檢控點(diǎn)通路ATM/Chk2和ATR/Chk1,損傷修復(fù)蛋白Ku70/80先上調(diào)后下調(diào),抑制修復(fù)蛋白R(shí)ad51的表達(dá)。四、JA和JB分別通過(guò)下調(diào)c-Myc和活化JNK通路阻滯PC3細(xì)胞于不同周期1.JA和JB阻滯PC3細(xì)胞于不同周期。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示,不同濃度JA(0,0.75,1.5μM)阻滯PC3細(xì)胞在Go/G1期的比例依次為56.74%,69.63%和76.67%；而JB(0,2.5,5μM)阻滯PC3細(xì)胞于G2/M期的細(xì)胞比例為10.58%,13.58%和27.66%。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物JA可降低PC3細(xì)胞內(nèi)的Cyclin D1、Cyclin E 與 CDK4等,上調(diào)p21CIP表達(dá)。JB化合物可降低細(xì)胞內(nèi)周期蛋白Cyclin B1和phospho-Cdc2,同時(shí)顯著上調(diào)p21CIPI。2.JA與JB分別通過(guò)下調(diào)c-Myc和活化JNK通路阻滯PC3細(xì)胞于不同周期。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞經(jīng)JA處理后,癌基因c-Myc表達(dá)量顯著下降,通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)c-Myc后,JA對(duì)PC3細(xì)胞Go／G1期阻滯作用由74.54%到81.23%,逆轉(zhuǎn)阻滯作用由72.03%到75.43%。通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)P I3K/AKT、p38與JNK三條MAPKs通路的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)化合物JB可顯著激活JNK通路,利用干擾RNA阻斷JNK通路后,JB對(duì)細(xì)胞G2／M期阻滯效果由9.02%到13.56%,逆轉(zhuǎn)效果由4.88%到6.72%。第四部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)及不足之處結(jié)論1.多西紫杉醇可通過(guò)誘導(dǎo)PCa細(xì)胞自噬促進(jìn)AGR2蛋白降解。2.低表達(dá)AGR2可誘導(dǎo)PCa產(chǎn)生多西紫杉醇耐藥。3.AGR2可通過(guò)促進(jìn)血管新生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。4.貝殼杉烷型二帖類化合物通過(guò)ROS途徑引起DNA損傷及其周期阻滯從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。二、創(chuàng)新點(diǎn)1.首次報(bào)道AGR2可抑制蛋白酶體活性,并發(fā)現(xiàn)對(duì)多西紫杉醇耐受的PCa細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑敏感。2.首次報(bào)道多西紫杉醇可通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)AGR2蛋白降解。3.首次報(bào)道AGR2可上調(diào)V EGFH R2的表達(dá),激活VEGF通路,促進(jìn)PCa血管新生,增強(qiáng)PCa侵襲轉(zhuǎn)移。三、不足之處1.AGR2抑制蛋白酶體活性的機(jī)制尚未研究清楚,但是與之相關(guān)的研究工作已經(jīng)開展。2.AGR2可分泌到胞外,胞外蛋白對(duì)VEGFR2的相互作用尚不清楚,但是已經(jīng)構(gòu)建了AGR2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)氨基酸序列突變的質(zhì)粒進(jìn)行下一步研究。3.化合物JB與多西紫杉醇對(duì)PCa的療效的對(duì)比工作尚未進(jìn)行研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25
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本文編號(hào)：1685135