本文選題：抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體　切入點(diǎn)：血管炎　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的： 抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是自身免疫性系統(tǒng)性小血管炎(Small vesselvasculitis，SVV)，因循環(huán)中存在ANCA包括髓過氧化物酶抗體(myeloperoxidase，MPO)和蛋白酶3抗體(protease3，PR3)而命名，腎臟病理主要表現(xiàn)為局灶壞死性腎小球腎炎(focal necrotizing glomerulonephritis，F(xiàn)NGN)，伴新月體形成，病情進(jìn)展兇險(xiǎn)，通常導(dǎo)致快速進(jìn)展的腎功能衰竭，愈后很差[1]。人溶酶體膜蛋白-2(human lysosomalmembrane proteins2,hLAMP-2)抗體是新近由Kain等[2，3]報(bào)道的一種ANCA新亞型，與腎臟損傷高度相關(guān)，其由細(xì)菌鞭毛FimH蛋白通過“分子模擬”(Molecular Mimicry，MM)機(jī)制致病，即革蘭氏陰性桿菌的鞭毛蛋白第72至80位氨基酸殘基多肽(FimHP72-80)與人LAMP-2第41至49位氨基酸殘基多肽(LAMP-2P41-49)具有100%同源性，導(dǎo)致機(jī)體識別病原體FimH抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，也直接作用于自身抗原LAMP-2蛋白，導(dǎo)致小血管及腎臟的壞死性病變[2]。提示細(xì)菌入侵人體后，通過FimH啟動(dòng)針對LAMP-2的自身免疫是ANCA相關(guān)性FNGN發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。 不同于Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞，Th17細(xì)胞是新型的CD4+輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)亞群，通過分泌白介素-17(interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）等炎癥因子，參與機(jī)體重要生理或病理進(jìn)程。Nogueira等[4]研究發(fā)現(xiàn)，急性期AAV患者血清IL-17A水平顯著升高，腎組織上可見IL-17大量表達(dá)，血清IL-23及MPO和PR3特異性的Th17細(xì)胞數(shù)均增高，提示IL-17在AAV的發(fā)生中起重要作用[1]。無論在ANCA陽性的血管炎患者，還是血管炎小鼠模型，均存在MPO-ANCA或PR3-ANCA特異性的Th17細(xì)胞克隆及反應(yīng)[2]，提示Th17細(xì)胞可能參與了ANCA相關(guān)的病理損傷。然而，細(xì)菌感染后如何激活宿主自身免疫，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探索。含鞭毛蛋白（FimH）的細(xì)菌感染后，IL-17變化情況及其與腎臟損傷是否相關(guān)，目前還未見報(bào)道。 LAMP-2抗體的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為開創(chuàng)了繼傳統(tǒng)ANCA的又一個(gè)新紀(jì)元，但是否能成為臨床診斷AAV的血清學(xué)標(biāo)志目前還存在爭議[3,4,5]，其敏感性和特異性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究擬從臨床出發(fā)，通過診斷性試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)，探討LAMP-2抗體在本單中心對AAV的診斷價(jià)值；同時(shí)從發(fā)病機(jī)制出發(fā)，，構(gòu)建FimH融合蛋白表達(dá)載體并純化，聯(lián)合Titermax Gold佐劑，皮下免疫WKY大鼠，初步觀察大鼠腎小球損傷及血清IL-17A水平、與蛋白尿相關(guān)性等，進(jìn)一步探討感染與AAV自身免疫的可能機(jī)制。 方法： 1. LAMP-2抗體在AAV中臨床價(jià)值評價(jià)按改進(jìn)的美國Chapel Hill血管炎會議(CHCC)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，篩選2010年09月至2013年06月，就診于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科的AAV新月體腎炎患者32例，其中28例腎活檢明確為新月體腎炎，以ANCA陰性其他腎小球腎炎42例為病例對照組；50例健康志愿者，為健康對照組。入院后收集各組血清，以健康志愿者血清光密度（optical density，OD）值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）作為參考值截止值(cut off值)。以重組人LAMP-2/CD107b為包被抗原（RD公司），間接ELISA法檢測血清LAMP-2抗體。參照試劑盒說明，采用歐蒙印跡法及間接免疫熒光法檢測MPO、PR3及GBM等(歐蒙醫(yī)學(xué)診斷股份公司)。列出診斷性實(shí)驗(yàn)四格表，計(jì)算診斷評價(jià)指標(biāo)：敏感度(sensitivity,Sen)、特異度(specificity, Spe)、陽性預(yù)測值(positive predictive value,PPV)、陽性似然比(positivelikelihood ratio, PLR)、陰性預(yù)測值(negative predictive value, NPV)、陰性似然比(negativelikelihood ratio, NLR)及約登指數(shù)(Youden index, YI)等。 2. FimH1-156融合蛋白的制備PCR法克隆pPKL241質(zhì)粒獲取FimH1-156基因，插入原核表達(dá)載體pET28a(+)；將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感受態(tài)E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)FimH融合蛋白，超聲裂解細(xì)菌，Ni-NTA層析法進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析、Western印跡法對其進(jìn)行鑒定。LAMP-2表位肽P41-49的合成及鑒定由杭州中肽生物有限公司合成，并經(jīng)質(zhì)譜鑒定，純度大于95%。 3. FimH1-156融合蛋白及LAMP-2表位肽P41-49誘導(dǎo)的病理模型：融合蛋白模型組：采用純化的大腸桿菌FimH融合蛋白(150μg)聯(lián)合Titermax金佐劑(150μl)皮下注射免疫Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，融合蛋白對照組：采用PBS(150μl)+Titermax金佐劑(150μl)。多肽模型組：采用完全弗氏佐劑聯(lián)合LAMP-2表位肽P41-49免疫WKY大鼠，在每只WKY大鼠尾根部皮下注射600μl雞尾酒式乳化液：內(nèi)含300μl完全弗氏佐劑以及300μl雙蒸水溶解的0.3mg LAMP-2多肽P41 49。多肽對照組：大鼠采用雙蒸水代替多肽免疫大鼠。監(jiān)測各時(shí)間點(diǎn)(0、3、7、14、21、28、35、50天)大鼠24小時(shí)尿蛋白總量的變化，于免疫后21天、35天和50天檢測大鼠血清尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)水平，觀察腎、肺組織病理變化，ELISA法檢測血清IL-17A水平。 結(jié)果： 1.2010年9月至2013年6月期間，符合納入標(biāo)準(zhǔn)的AAV新月體腎炎患者32例，其他腎小球腎炎42例。50名健康志愿者來自新橋醫(yī)院健康體檢中心。在32例AAV中，30例檢出LAMP-2抗體陽性。而在42例疾病對照組中，7例檢出陽性。其中ANCA陰性、其他自身抗體陰性的新月體腎炎檢出LAMP-2抗體的4例。健康對照組無陽性抗體檢出。列出診斷性實(shí)驗(yàn)四格表后，計(jì)算出其敏感度(Sen)、特異度(Spe)、陽性預(yù)測值(PPV)、陰性預(yù)測值(NPV)、陽性似然比(PLR)、陰性似然比(NLR)及約登指數(shù)(YI)，分別為93.8%、83.3%、81.1%、94.6%、5.625、0.075和0.771。 2.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-FimH1-156，經(jīng)對融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化，在IPTG濃度為1mmol/L誘導(dǎo)4h后，目的蛋白表達(dá)量最高，主要以包涵體形式存在；WB證實(shí)該FimH1-156融合蛋白可與抗6×His單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。 3.融合蛋白模型組的大鼠24小時(shí)尿蛋白總量在免疫后第3天開始升高，第7天、35天、50天時(shí)顯著高于其對照組(p0.05)；免疫后50天，大鼠血清UREA、CREA、UA水平，均顯著高于其對照組(p0.05)；免疫后35天，腎臟組織顯示局灶壞死，免疫后50天新月體形成，肺泡壁增厚、部分?jǐn)嗔�；免疫WKY大鼠35天后，血清IL-17A表達(dá)均顯著高于其對照組(p0.05)； IL-17A與24小時(shí)尿蛋白之間存在明確相關(guān)性(R=0.5566，p=0.0210)。多肽模型組的大鼠在13天時(shí)24小時(shí)尿蛋白定量顯著高于多肽對照組(P0.05)；腎臟損傷無明顯特異性，可見系膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯局灶壞死及新月體形成；IL-17A水平表達(dá)也顯著高于多肽對照組(P0.05)。 結(jié)論： 1. LAMP-2抗體對AAV所致新月體腎炎具有較好的診斷價(jià)值，并在ANCA陰性的新月體腎炎發(fā)現(xiàn)LAMP-2抗體，需進(jìn)一步大樣本驗(yàn)證。 2.成功克隆FimH1-156融合蛋白表達(dá)基因并構(gòu)建至原核表達(dá)載體，獲得了包涵體純化的FimH1-156融合蛋白，為下一步建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎損傷模型奠定了基礎(chǔ)。 3.細(xì)菌FimH融合蛋白誘導(dǎo)大鼠腎小球局灶壞死性損傷及肺損傷，IL-17A參與了FimH融合蛋白誘導(dǎo)的大鼠肺、腎損傷過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1620541