本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 微囊泡 腎臟纖維化 促紅細(xì)胞生成素 微小RNA　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的：既往研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)在細(xì)胞和組織損傷的修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)可以提升MSC在組織和器官損傷中的修復(fù)作用。MSC外泌的微囊泡(Microvesicle, MV)可以修復(fù)急慢性腎損傷。因此,進(jìn)一步研究EPO對(duì)MSC外泌的MV在修復(fù)腎臟纖維化方面的影響。研究方法：收集并提取常規(guī)培養(yǎng)條件下MSC來(lái)源的hMV (MSC-MVs)和經(jīng)過(guò)不同濃度EPO (1,10,100和500 IU/mL)共培養(yǎng)條件下MSC來(lái)源的MV(EPO-MVs).體外實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞系(HK2)發(fā)生纖維化,并用MSC-MVs和EPO-MVs進(jìn)行干預(yù)治療。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)HK2細(xì)胞的表型改變,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HK2細(xì)胞的凋亡情況。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO)的腎臟損傷模型,MSC-MVs和EPO-MVs干預(yù)治療后通過(guò)腎臟組織病理,腎臟纖維化標(biāo)志蛋白改變及腎功能指標(biāo)變化來(lái)評(píng)估各實(shí)驗(yàn)組小鼠的腎臟功能。運(yùn)用miRNA的微列陣來(lái)檢測(cè)MSC-MVs和EPO-MVs內(nèi)各自miRNA表達(dá)譜,尋找出其內(nèi)差異表達(dá)miRNA,并運(yùn)用軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。研究結(jié)果：與常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC組相比,在1-100 IU/mL EPO共培養(yǎng)條件下的EPO-MSC其外泌MV的含量隨著EPO刺激濃度的增加呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)。1OOIU/ml EPO濃度下提取的EPO-MVs相較于常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC-MVs在體外TGF-β1誘導(dǎo)HK2纖維化時(shí),EPO-MVs的干預(yù)治療比MSC-MVs有更顯著的效果。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,MSC-MVs和EPO-MVs均可一定程度上減輕由TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞凋亡,并且EPO-MVs的效果更佳。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,最優(yōu)EPO濃度下提取的EPO-MVs在7天和14天對(duì)UUO小鼠的腎臟損傷修復(fù)中呈現(xiàn)了比常規(guī)培養(yǎng)條件下的MSC-MVs更好的治療效果。此外,MSC-MVs和EPO-MVs的miRNA表達(dá)譜對(duì)比分析結(jié)果顯示,EPO-MVs中共有212個(gè)miRNAs表達(dá)發(fā)生變化,其中有70.28%的miRNA是表達(dá)上調(diào)的(包括miR-299a-3p, miR-449b, miR-302b-5p和miRNA-200a-3p)。這些上調(diào)變化的miRNA可能是造成EPO-MVs在腎臟損傷修復(fù)作用中效果優(yōu)于MSC-MVs的原因。結(jié)論：在1-100 IU/mL EPO的濃度范圍內(nèi),EPO-MSC分泌的EPO-MVs濃度與EPO濃度正相關(guān)。MSC-MVs和EPO-MVs均可以在體內(nèi)和體外水平治療腎小管纖維化導(dǎo)致的腎臟損傷,并且EPO-MVs治療效果更為優(yōu)異。
[Abstract]:Objective: previous studies have shown that bone marrow mesenchymal Stem Cells. The erythropoietin Erythropoietin (Erythropoietin) plays an important role in the repair of cell and tissue injury. EPO can enhance the repair effect of MSC in tissue and organ injury. MSC exocrine microvesicle can repair acute and chronic renal injury. To further study the effect of EPO on the repair of renal fibrosis by MSC secreted MV. Methods: to collect and extract MSC-MVsof hMV derived from MSC under conventional culture conditions. And after different concentrations of EPO. 10. In vitro experiment: transforming growth factor- 尾 1 (TGF- 尾 1) in vitro. Transforming growth factor- 尾 1. TGF- 尾 1) induced fibrosis in human proximal tubule epithelial cell line (HK2). Western blot and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to treat the patients with MSC-MVs and EPO-MVs. Methods the phenotypic changes of HK2 cells were detected. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of HK2 cells in each experimental group. In vivo, the renal injury model of unilateral ureteral ligation model (UUO) was established. Renal histopathology was adopted after intervention of MSC-MVs and EPO-MVs. The changes of renal fibrosis marker protein and renal function indexes were used to evaluate the renal function of mice in each experimental group. The microarray of miRNA was used to detect the miRN in MSC-MVs and EPO-MVs. A expression profile. Find out the differential expression of miRNAs, and use software to predict the target gene. Results: compared with the conventional culture of MSC group. Under the co-culture condition of 1-100 IU/mL EPO, the exocrine MV content of EPO-MSC increased significantly with the increase of EPO stimulation concentration. Compared with MSC-MVs in conventional culture, EPO-MVs extracted at the concentration of EPO was induced by TGF- 尾 1 in vitro. The intervention of EPO-MVs was more effective than that of MSC-MVs. Both MSC-MVs and EPO-MVs could attenuate the apoptosis of HK2 cells induced by TGF- 尾 1 to some extent, and the effect of EPO-MVs was better. The EPO-MVs extracted at the optimal concentration of EPO showed a better therapeutic effect on the renal injury repair of UUO mice on the 7th and 14th day than that of the MSC-MVs cultured in the conventional culture condition. The comparative analysis of miRNA expression profiles of MSC-MVs and EPO-MVs showed that there were 212 miRNAs expression changes in EPO-MVs. 70.28% of the miRNA were up-regulated (including miR-299a-3p, miR-449b). MiR-302b-5p and miRNA-200a-3p). These upregulated changes of miRNA may be the reason why EPO-MVs is superior to MSC-MVs in renal injury repair. Conclusion: in 1-100 IU/mL, the effect of EPO-MVs is better than that of MSC-MVs. Within the concentration range of EPO. The concentration of EPO-MVs secreted by EPO-MSC is positively correlated with the concentration of EPO. MSC-MVs and EPO-MVs can treat renal injury caused by renal tubular fibrosis in vivo and in vitro. . And EPO-MVs treatment is more excellent.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692

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