本文關(guān)鍵詞：Notch信號調(diào)控巨噬細胞參與腎纖維化的作用及機制研究

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【摘要】：【背景】腎臟纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎病的最終共同途徑,一般需要腎臟替代治療,如得不到及時處理,甚至導致死亡。腎纖維化是炎癥損傷修復的反應(yīng)各種腎臟損傷都能引起小管上皮細胞的變性壞死,同時伴隨著各種炎癥細胞浸潤和炎性因子釋放,導致成纖維細胞的激活和增生,最終造成促纖維化物質(zhì)的形成和ECM的大量堆積。前人對腎纖維化的病理生理機制進行了大量的探索性研究,盡管取得了一系列階段性的成果,但對其發(fā)病機制仍不甚明了。從細胞層面講,腎臟自身細胞和骨髓來源的細胞共同參與腎損傷的進展。腎臟損傷后炎癥介質(zhì)誘導骨髓細胞浸潤到腎間質(zhì),尤其是單核巨噬細胞介導的先天免疫反應(yīng)尤為突出。以往研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞具有促纖維化作用,而近幾年研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞不僅發(fā)揮促纖維化角色,甚至還能改善腎纖維化。主要原因與巨噬細胞的異質(zhì)性有關(guān)。但關(guān)于巨噬細胞異質(zhì)性在腎纖維化中的作用和機制目前尚不清楚。大量的研究顯示多種信號通路參與調(diào)控巨噬細胞的活化,其中Notch信號是調(diào)控巨噬細胞活化的重要信號通路之一,提示:Notch信號可能通過調(diào)控巨噬細胞的活化參與腎纖維化進程。Notch信號是進化上高度保守的單次跨膜受體蛋白,當機體受到外界刺激時,Notch信號介導細胞間的信息傳遞,參與調(diào)控細胞發(fā)育的一系列生物學行為。大量研究顯示Notch信號不僅參與腎小管、集合管發(fā)育,而且與腎纖維化的形成密切相關(guān)。最近研究顯示在小管上皮細胞特異性敲除Notch后纖維化程度減輕,提示:Notch信號可以促進腎纖維化的進展。已知腎纖維化是個慢性炎癥損傷修復的過程,作為炎癥的起始應(yīng)答細胞的巨噬細胞在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。那么在巨噬細胞中特異性敲除或激活Notch信號通路是否影響纖維化的進程是個令人感興趣的問題�！灸康摹繛榱烁娴年U明Notch信號調(diào)控巨噬細胞參與腎纖維化的作用和機制,我們利用巨噬細胞特異性Notch信號敲除或激活的小鼠模型,在UUO誘導的腎纖維化模型中,利用分子生物學和免疫學方法,從分子、細胞和動物水平分析Notch信號調(diào)控巨噬細胞參與腎纖維化的作用和機制,以期為將來靶向巨噬細胞干預(yù)Notch信號進行腎纖維化治療提供新靶點和新策略�！痉椒ā�1.將對照小鼠(lyz2-cre/RBP-J+/flox)、巨噬細胞特異性RBP-J剔除小鼠(lyz2-cre/RBP-Jflox/flox)、巨噬細胞特異性激活Notch小鼠(lyz2-cre/STOPflox-NICD)的左側(cè)輸尿管結(jié)扎,建立UUO模型。2.Masson、免疫熒光染色、q RT-PCR檢測小鼠UUO模型中纖維化水平的變化。3.HE,q RT-PCR、ELISA檢測小鼠UUO模型中炎性細胞浸潤以及促炎促纖維化因子的變化。4.免疫熒光染色、流式細胞術(shù)、q RT-PCR檢測巨噬細胞的浸潤及極化;q RT-PCR、免疫熒光染色檢測腎纖維化中巨噬細胞Notch信號的活化。5.Western blot、q RT-PCR、體外共培養(yǎng)實驗檢測在巨噬細胞特異性阻斷RBP-J后腎小管上皮細胞EMT的改變。6.利用脂質(zhì)體包裹的氯磷酸鹽清除腎臟組織定居型巨噬細胞實驗,通過FACS、組織學染色檢測組織定居巨噬細胞對腎臟纖維化貢獻。7.利用Brdu體內(nèi)參入實驗,通過FACS檢測巨噬細胞增殖對腎纖維化的貢獻。【結(jié)果】1.成功建立UUO誘導的纖維化模型。2.UUO第14天時纖維化程度和間質(zhì)炎癥細胞浸潤都高于第7天;UUO后巨噬細胞浸潤明顯增多,且第7天和14天以M2型巨噬細胞浸潤為主,然而UUO第7天和14天時M1型巨噬細胞的數(shù)量沒有顯著不同。3.纖維化過程中巨噬細胞的Notch信號通路被激活。4.巨噬細胞特異性敲除Notch信號后,腎臟纖維化程度減輕。表現(xiàn)在:Notch信號剔除后抑制了EMT發(fā)生和促纖維化因子釋放;減少了炎癥細胞浸潤和炎癥因子的釋放。5.氯磷酸鹽清除腎臟原位巨噬細胞結(jié)果顯示:Notch主要通過影響骨髓來源的巨噬細胞參與腎纖維化;另外阻斷Notch信號并不影響炎性巨噬細胞的增殖。6.巨噬細胞特異性敲除Notch信號后,腎臟中巨噬細胞的浸潤減少,其中巨噬細胞中CCR2表達顯著減少;FACS結(jié)果顯示大量的CCR2+的單核-巨噬細胞被滯留在骨髓。7.利用巨噬細胞特異性激活Notch的小鼠建立小鼠纖維化模型后,FACS、組織學染色結(jié)果顯示:腎臟中CCR2+炎癥巨噬細胞的募集增多,腎臟纖維化水平加重。【結(jié)論】1.UUO誘導的腎纖維化后期主要是M2型巨噬細胞參與腎臟纖維化進展。且纖維化腎臟中巨噬細胞的Notch信號通路被激活。2.在UUO誘導的腎纖維化模型中,RBP-J介導的Notch信號的缺失,導致纖維化程度減低。其機制并不是通過影響巨噬細胞增殖和原位巨噬細胞的轉(zhuǎn)化,其主要是通過調(diào)控骨髓來源的CCR2+巨噬細胞募集進而參與腎纖維化進展。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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本文編號：1245461