本文關(guān)鍵詞：四因子誘導(dǎo)iPSCs方法的改良及大鼠腎臟固有細(xì)胞來(lái)源的iPSCs的獲得

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【摘要】：背景：近年來(lái),慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。對(duì)于終末期腎臟病患者,主要的替代治療方法是透析和腎移植。但是不論哪種方法都不能很好地維持其機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,更不能替代腎臟的分泌功能,而且腎移植供體供不應(yīng)求。組織工程與干細(xì)胞領(lǐng)域的突飛猛進(jìn)為器官再生帶來(lái)了希望。有研究表明利用小鼠脫細(xì)胞的腎臟細(xì)胞外基質(zhì)作為骨架,通過(guò)腎動(dòng)脈向骨架內(nèi)灌注小鼠胚胎干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞可在骨架內(nèi)定植,并能分化為相應(yīng)的腎臟固有細(xì)胞。此前,我們課題組已成功獲取大鼠脫細(xì)胞腎臟骨架并對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行了檢測(cè)。但是胚胎干細(xì)胞存在倫理問(wèn)題。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)具有與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的全能特性。利用iPSCs代替胚胎干細(xì)胞,不僅解決了倫理問(wèn)題,同樣在保持大量擴(kuò)增能力的同時(shí)還具有胚胎干細(xì)胞的發(fā)育能力。目的：綜合國(guó)內(nèi)外加速體細(xì)胞重編程效率的有效方法改良iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率,并提取原代的大鼠腎臟固有細(xì)胞,分別誘導(dǎo)為不同來(lái)源的iPS細(xì)胞,最后再灌注到脫細(xì)胞腎骨架中觀(guān)察其生存情況。方法：(1)利用慢病毒載體結(jié)合抑制細(xì)胞的Mbd3基因,并在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入維生素C加血清替代物,同時(shí)適當(dāng)提高接種密度的方法改良iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率;(2)分別提取并培養(yǎng)原代的大鼠腎臟系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等主要的腎臟固有細(xì)胞,分別誘導(dǎo)為不同細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞,并做熒光標(biāo)記;(3)將帶有熒光標(biāo)記的iPS細(xì)胞灌注到脫細(xì)胞腎骨架中觀(guān)察其存活情況。結(jié)果：(1)利用改良過(guò)的iPS誘導(dǎo)方法成功將誘導(dǎo)周期由7天縮短至5天;(2)利用篩網(wǎng)及貼壁法,我們成功提取了主要的腎臟固有細(xì)胞,并分別用改良方法誘導(dǎo)成為各種不同細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞,保留了對(duì)不同腎臟固有細(xì)胞的記憶性;(3)將帶有RFP的大鼠iPS細(xì)胞灌入脫細(xì)胞腎骨架中,48小時(shí)后在雙光子顯微鏡下觀(guān)察其生長(zhǎng)情況,結(jié)果示其生長(zhǎng)狀態(tài)良好。結(jié)論：(1)改良過(guò)的iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)方法可縮短iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)周期;(2)利用篩網(wǎng)及貼壁法,可成功提取主要的腎臟固有細(xì)胞,并且改良方法誘導(dǎo)也可成功將其誘導(dǎo)為各種不同細(xì)胞來(lái)源的iPS細(xì)胞,為下一步實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟再生做準(zhǔn)備;(3)大鼠iPSCs可以部分在脫細(xì)胞腎臟骨架內(nèi)存活。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R692

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1241822