本文關(guān)鍵詞：精子鉀離子通道的調(diào)節(jié)機制和功能研究

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【摘要】：研究背景和目的:隨著現(xiàn)代生活方式和環(huán)境的改變,不孕不育呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。目前,大約有15%的配偶存在不同程度的生殖障礙,其中約50%與男性有關(guān),闡明精子功能調(diào)控機制是精準診斷與治療男性不育的基礎。精子進入雌性生殖道與卵子結(jié)合之前,必須經(jīng)歷獲能、超活化、頂體反應等一系列復雜的變化過程,生理或環(huán)境因子所導致的其中任一步驟失常均可能影響最終的受精。KSper鉀離子通道與CatSper鈣離子通道是二種重要的精子特異性離子通道。KSper由主亞基Slo3和輔助亞基LRRC52組成。Slo3基因敲除雄性小鼠不育,而LRRC52敲除小鼠的生殖能力也嚴重受損,表明KSper是調(diào)控精子功能的關(guān)鍵因子。已知生理條件下精子胞內(nèi)pH升高是激活KSper的關(guān)鍵因子。然而,有關(guān)精子胞內(nèi)pH的調(diào)控機制、哪些分子通過調(diào)控精子胞內(nèi)pH而激活KSper遠未闡明。此外,環(huán)境因子是否能通過作用于KSper而影響精子功能也未見報道。根據(jù)精子上存在鈉氫交換器(NHE)、其可能在精子的pH調(diào)控中起作用等文獻報道,本研究試圖闡明NHE是否是生理條件下調(diào)控KSper的重要分子;此外,本研究還試圖闡明KSper是否介導了廣受關(guān)注的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A(BPA)的精子功能損傷效應。通過本課題的研究,期望能夠進一步闡明精子特異性通道KSper的調(diào)節(jié)機制及其功能,從而為深入認識精子功能調(diào)控機制、環(huán)境因子的精子損傷機制提供新的信息。實驗設計:1、通過NHE抑制劑研究其在KSper激活中的作用。要求此抑制劑對KSper通道并無抑制或激活作用,才能保證所觀察的效應來自NHE�；贙Sper激活將因鉀離子外流而導致細胞膜超極化這一特點,細胞膜電位的改變直接反映KSper抑制或激活、從而反映pH的改變。因此,通過膜片鉗技術(shù)測定在不同pH的電極內(nèi)液和不同緩沖能力的電極內(nèi)液,檢測NHE抑制劑對小鼠精子膜電位的影響,有望闡明NHE是否是通過調(diào)控pH而調(diào)控KSper通道的重要分子。此外還將通過CASA和頂體反應技術(shù)檢測抑制劑對小鼠精子運動和頂體反應的影響。2、通過體內(nèi)和體外實驗檢測BPA在不同濃度時對KSper離子通道表達和功能的影響。體內(nèi)實驗中通過喂養(yǎng)不同濃度的BPA三個月,然后檢測構(gòu)成KSper的主亞基Slo3蛋白的表達情況、KSper電流和精子運動與頂體反應。體外實驗中則用不同濃度的BPA處理精子樣品后,檢測精子KSper通道的電流、運動和頂體反應情況。實驗結(jié)果:1、篩選出對KSper通道無作用的NHE抑制劑:DMA;2、當胞內(nèi)低pH緩沖時(電極內(nèi)液未添加緩沖劑Hepes),生理外液中添加DMA顯著導致小鼠精子膜電位去極化、表明生理條件下NHE對升高胞內(nèi)pH、激活KSper具有重要作用;3、當胞內(nèi)高pH緩沖時(電極內(nèi)液含20mMHepes),生理外液中添加DMA對小鼠精子膜電位的去極化效應大大降低,進一步表明上述效應是由pH而不是其它未知因素介導的;4、胞內(nèi)pH只影響精子的初始膜電位,但不影響DMA的去極化效應,提示兩種情況下NHE均具有功能;5、熒光測量法表明DMA降低精子胞內(nèi)pH,與上述結(jié)果一致;6、DMA顯著抑制孕酮介導的小鼠精子頂體反應,但對小鼠精子運動和自發(fā)頂體反應無顯著影響;7、喂養(yǎng)BPA的小鼠精子運動能力降低、頂體反應能力降低;但喂養(yǎng)小鼠精子的Slo3蛋白表達、KSper電流均未受影響;8、BPA直接孵育小鼠精子能損害精子運動、頂體反應等能力,但直接施加BPA不影響KSper電流,而抑制CatSper電流。結(jié)論:1、生理條件下NHE是調(diào)控精子胞內(nèi)pH、并因此而調(diào)控KSper的重要分子。本實驗為NHE通過調(diào)節(jié)pH來調(diào)控KSper離子通道提供了直接的實驗證據(jù),NHE抑制劑DMA通過抑制NHE轉(zhuǎn)運體降低小鼠精子胞內(nèi)pH,進而使小鼠精子由KSper介導的膜電位發(fā)生去極化;DMA對孕酮誘導的頂體反應的抑制可能與上述效應相關(guān)。2、環(huán)境干擾素BPA對小鼠精子的運動和頂體反應有明顯的抑制,但是BPA對小鼠精子KSper的表達和功能無顯著影響,其作用可能通過影響另一個精子特異性離子通道CatSper而實現(xiàn)。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2

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