本文關(guān)鍵詞：腎小管上皮細(xì)胞C3aR的表達(dá)調(diào)控及其活化作用研究

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【摘要】：研究背景補(bǔ)體系統(tǒng)是一種生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系,具有復(fù)雜而精密的調(diào)控機(jī)制,包含30多種血漿和細(xì)胞相關(guān)蛋白。補(bǔ)體系統(tǒng)組成成分大致可分為能與細(xì)胞結(jié)合的固有成分、各種調(diào)節(jié)因子以及相關(guān)的補(bǔ)體受體等。補(bǔ)體系統(tǒng)能被眾多因素激活發(fā)生級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng),這些因素包括病原體、自身抗體、細(xì)胞凋亡以及組織的缺血缺氧和壞死等。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活主要通過(guò)三種途徑,即經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)途徑。三種活化途徑生成的C3轉(zhuǎn)化酶促使補(bǔ)體C3活化、裂解,釋放C3b調(diào)理素、生成C5轉(zhuǎn)化酶,最后形成C5b-9,也稱(chēng)作膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex, MAC)。C5b-9能夠破壞靶細(xì)胞的磷脂雙分子層,導(dǎo)致細(xì)胞損傷以及凋亡,它還能夠活化中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞,參與炎性反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)也是先天免疫的一個(gè)重要組成部分,它們可以識(shí)別來(lái)源于普通病原體的保守抗原,并做出迅速而強(qiáng)烈的回應(yīng)。而除參與機(jī)體的宿主防御外,補(bǔ)體系統(tǒng)正�；虍惓＜せ钸�參與包括腎臟病在內(nèi)多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展。以往人們對(duì)腎臟疾病中的補(bǔ)體系統(tǒng)功能的關(guān)注更多的是MAC效應(yīng),然而近年來(lái),在補(bǔ)體活化過(guò)程中,由補(bǔ)體C3通過(guò)C3轉(zhuǎn)化酶催化而裂解生成的小片段C3a以及其特異性受體C3aR在腎臟疾病病理過(guò)程中的作用逐漸受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)過(guò)三種途徑激活后共同生成C3轉(zhuǎn)化酶,并催化裂解補(bǔ)體C3,使其生成大片段C3b和其代謝物(iC3b,C3dg)以及小片段(C3a), C3b再經(jīng)過(guò)一系列級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng),最終生成C5b-9。C3a是一個(gè)大約包含77個(gè)氨基酸殘基的多肽,作為一種強(qiáng)效的促炎因子,除了能夠參與機(jī)體的先天性免疫反應(yīng),C3a還能作用于廣泛的免疫及非免疫性細(xì)胞發(fā)揮眾多的生物學(xué)效應(yīng)。例如,調(diào)節(jié)血管舒張,增加小血管的通透性,引發(fā)平滑肌的收縮。對(duì)于有吞噬功能的細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞),C3a有強(qiáng)烈的化學(xué)趨化作用,使吞噬細(xì)胞遷移至組織的損傷或炎癥區(qū)域。C3a還能促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放組胺,引發(fā)中性粒細(xì)胞的氧化猝發(fā)現(xiàn)象。C3a還參與組織的再生和纖維化過(guò)程,如促進(jìn)肝臟組織的再生。C3aR是C3a的特異性受體,它屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCR)超級(jí)家族的一員,擁有一個(gè)通過(guò)胞內(nèi)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)鏈接的7次跨膜結(jié)構(gòu)域。在過(guò)去的十年中,已有許多文獻(xiàn)報(bào)道C3aR表達(dá)于眾多類(lèi)型細(xì)胞上。眾所周知,對(duì)于骨髓源性細(xì)胞,如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及肥大細(xì)胞等均能檢測(cè)到C3aR的表達(dá),當(dāng)然,C3aR也會(huì)表達(dá)于如活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞這類(lèi)非骨髓源性細(xì)胞上。而近幾年的研究表明,在腎臟組織中,其小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞也均能表達(dá)C3aR,且多種腎臟疾病模式小鼠的腎組織中,C3aR mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào),這種表達(dá)上調(diào)在腎臟疾病發(fā)病前就己出現(xiàn),說(shuō)明C3a/C3aR軸異常激活參與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展,而不是單純由疾病導(dǎo)致的伴隨現(xiàn)象。腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體系統(tǒng)激活的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,許多研究發(fā)現(xiàn),腎臟疾病如：各類(lèi)自身抗體介導(dǎo)的腎小球腎炎,C3腎小球沉積病,移植腎后缺血再灌注損傷以及抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)均有補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的參與,且各個(gè)補(bǔ)體成分或調(diào)控因子所發(fā)揮的作用并不相同。作為補(bǔ)體系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分,C3a/C3aR軸在腎臟疾病中的作用逐漸受到眾多學(xué)者們的重視,而一些相關(guān)文獻(xiàn)也表明C3a/C3aR軸正�；虍惓；罨谀I臟疾病中起著更為直接和顯著的作用,也預(yù)示著C3a/C3aR軸可能是治療相關(guān)腎臟疾病的一個(gè)新治療靶點(diǎn)。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是一種進(jìn)展性的腎臟纖維化疾病,是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥,也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在以往的工作當(dāng)中,我們觀察到,DN患者以及糖尿病小鼠的腎組織中C3aR表達(dá)均顯著上調(diào),我們推測(cè)C3a/C3aR軸活化在DN中也發(fā)揮了重要作用,但是具體機(jī)制不清,為了更好地了解腎臟組織中C3aR表達(dá)調(diào)控因素,我們研究了多種炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β1)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞)C3a受體表達(dá)調(diào)控。另外,腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化是DN腎臟損害的重要表現(xiàn),一些研究顯示,上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用,我們猜測(cè)C3a/C3aR軸的活化可能引發(fā)小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化進(jìn)而加速腎臟纖維化的進(jìn)展,因此,我們構(gòu)建了鼠原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定的方法,并探究C3aR活化是否能夠引起鼠小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。第一部分炎癥細(xì)胞因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞C3a受體的表達(dá)調(diào)控目的在以往的工作中,我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病患者的腎組織中C3aR表達(dá)增加,但其具體機(jī)制不清,因此,為了更好了解腎臟組織中C3aR表達(dá)調(diào)控因素,我們研究了多種炎性細(xì)胞因子對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2細(xì)胞)C3a受體表達(dá)的調(diào)控作用。方法HK2細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。將HK2細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于12孔板中,放入37℃、含5%C02細(xì)胞孵育箱進(jìn)行培養(yǎng),待孔內(nèi)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%融合時(shí)換成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化12-18h。用多種炎癥因子(IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β)與已同步化的HK2細(xì)胞共培育,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn),每種炎癥因子刺激分為濃度梯度及時(shí)間梯度組,利用Real-time PCR檢測(cè)HK2細(xì)胞C3aR mRNA的表達(dá)水平。選擇對(duì)HK2細(xì)胞C3aR mRNA表達(dá)具有顯著促進(jìn)作用的炎性因子IFN-γ作為刺激劑刺激HK2細(xì)胞,通過(guò)免疫組織化學(xué)及免疫印跡的方法探測(cè)HK2細(xì)胞C3aR蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子IFN-γ能夠顯著的促進(jìn)HK2細(xì)胞C3aR的表達(dá)上調(diào)(與正常對(duì)照組相比,C3aR mRNA表達(dá)水平增長(zhǎng)大約5倍,P=0.001,蛋白水平表達(dá)上調(diào)大約1.6倍,P=0.046),且HK2細(xì)胞C3aR mRNA水平表達(dá)上調(diào)與IFN-γ成劑量及時(shí)間依賴(lài)關(guān)系；而其他的炎性細(xì)胞因子如：TNF-α、TGF-β1、IL-1β甚至生物活性多肽C3a均未觀察到對(duì)HK2細(xì)胞C3aR表達(dá)造成影響。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)不僅證明了腎小管上皮細(xì)胞表面表達(dá)生物活性肽段C3a受體(C3aR),而且還證明了炎癥細(xì)胞因子IFN-γ能夠明顯增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞其C3aR表達(dá),預(yù)示著C3a/C3aR軸在腎臟疾病中參與了腎臟局部炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)并且與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)。第二部分C3aR激動(dòng)劑對(duì)小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞表型影響的研究構(gòu)建小鼠原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定的方法,探究C3aR活化是否能夠引起小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。方法首先,從小鼠腎組織中分離腎小管節(jié)段進(jìn)行腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng),步驟簡(jiǎn)述如下：小鼠處死消毒后于無(wú)菌環(huán)境中取出腎組織,腎皮質(zhì)移入冷PBS中并切成1mm左右的碎片,之后腎皮質(zhì)碎片移入5m1膠原酶溶液中,并在37℃搖床里震蕩消化1h；讓消化懸液通過(guò)孔徑為100umm的尼農(nóng)篩網(wǎng),殘留于篩網(wǎng)上的組織可以用無(wú)菌研缽輕輕碾壓。用37℃PBS稍作沖洗后,再用37℃并含I%BSA的PBS液反向沖洗100umm尼農(nóng)篩網(wǎng),收集其沖洗液于干凈離心管中,并以170g離心5min,得到的組織團(tuán)塊重懸于培養(yǎng)基中并接種于鋪好膠原的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板里,靜置于標(biāo)準(zhǔn)的濕化孵育箱中(37℃、5%CO2)48h待腎小管節(jié)段貼壁,之后每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基,約7天后細(xì)胞便會(huì)長(zhǎng)滿(mǎn)。將得到的原代腎小管上皮細(xì)胞傳一代后,制作細(xì)胞爬片,并用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用C3aR激動(dòng)劑與得到腎小管上皮細(xì)胞共培育,利用Real-time PCR和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中E-cadherin、α-SMA及collagen Ⅰ的表達(dá)水平變化。用鬼筆環(huán)肽對(duì)上皮細(xì)胞行骨架染色,觀察細(xì)胞骨架形態(tài)變化。結(jié)果腎小管節(jié)段懸液剛接入細(xì)胞培養(yǎng)板48h后,大部分小管節(jié)段貼壁,且有少量上皮樣細(xì)胞從小管節(jié)段中向外爬出,隨后細(xì)胞逐漸增多,呈島狀生長(zhǎng),細(xì)胞鏈接緊密,形態(tài)為多邊形或短梭形,到第7天時(shí),細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底為細(xì)胞單層,呈典型鵝卵石鋪路樣,透明性折光性強(qiáng)。免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞核周?chē)鞍|(zhì)E-cadherin染色均陽(yáng)性,陰性對(duì)照組無(wú)特殊染色。C3aR激動(dòng)劑能促進(jìn)α-SMA和collagen Ⅰ表達(dá)上調(diào)而抑制E-cadherin表達(dá),且三種分子各自的表達(dá)趨勢(shì)與C3aR激動(dòng)劑呈時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系,而細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示,隨著C3aR激動(dòng)劑刺激時(shí)間的延長(zhǎng),上皮細(xì)胞內(nèi)由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成的應(yīng)力纖維的生成逐漸增多。刺激時(shí)間大于12h時(shí),應(yīng)力纖維生成增加明顯。結(jié)論我們成功構(gòu)建了小鼠腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法,為以后對(duì)小鼠腎小管上皮細(xì)胞的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；我們也發(fā)現(xiàn)C3aR激動(dòng)劑能夠促進(jìn)鼠腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA和collagen Ⅰ,然而抑制其E-cadherin的表達(dá),還能使鼠腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)力纖維生成明顯增加,表明C3aR活化能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,表明在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著一定程度的作用,也預(yù)示著C3aR可能成為腎臟疾病治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R692

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