本文關(guān)鍵詞：膀胱癌中唾液酸酶Neu1的異常表達(dá)對Toll樣受體的影響研究

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【摘要】：哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的大部分蛋白或脂類均可能被糖基化修飾,而其糖鏈末端往往會被唾液酸化。唾液酸(Sialic acids,Sias)是一類九碳糖,報道顯示多種腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白質(zhì)和糖脂中唾液酸表達(dá)出現(xiàn)異常,一般認(rèn)為,腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移與其細(xì)胞表面的唾液酸的表達(dá)量呈正相關(guān),因此許多研究認(rèn)為可以將唾液酸作為潛在的腫瘤標(biāo)志物。與唾液酸代謝有關(guān)的酶分為兩類,一類是催化唾液酸修飾的唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Sialyltransferase,ST),一類是去除唾液酸修飾的唾液酸酶(Sialidase,SA或稱為Neuraminidase,Neu)。哺乳動物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)四種唾液酸酶Neu1,Neu2,Neu3,Neu4,最近研究發(fā)現(xiàn)唾液酸酶Neu1在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。因此,唾液酸酶Neu1作為水解釋放糖鏈中唾液酸殘基的酶,其相關(guān)研究能夠?qū)δ[瘤的診斷和治療提供一定的理論基礎(chǔ)。為研究Neu1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的角色,本研究以膀胱正常上皮細(xì)胞HCV29、非侵染性膀胱癌細(xì)胞KK47和侵染性的膀胱癌細(xì)胞J82、YTS-1和T24作為研究模型。首先用凝集素染色和特異熒光底物檢測比較這5株細(xì)胞中的唾液酸的表達(dá)和唾液酸酶的活性,并進(jìn)一步采用熒光定量PCR方法檢測相關(guān)的唾液酸酶和唾液酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)唾液酸酶Neu1在正常細(xì)胞中表達(dá)量最高,在非侵染性腫瘤細(xì)胞中次之,在侵染性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量最低。隨后采用半定量及定量PCR從m RNA水平,用Western blotting與細(xì)胞免疫熒光從蛋白水平驗證了Neu1的表達(dá)均與上述結(jié)果相符。另外,膀胱癌組織芯片的結(jié)果也同樣證實癌癥組織中Neu1含量表達(dá)量低于正常組織。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等相關(guān),而轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor,TGF-β)可以誘導(dǎo)這一過程。本實驗在Neu1表達(dá)量相對較高的三株細(xì)胞(HCV29,KK47,J82)中添加TGF-β誘發(fā)EMT,發(fā)現(xiàn)伴隨EMT的發(fā)生,Neu1表達(dá)量顯著下調(diào)。繼而通過在膀胱癌細(xì)胞YTS-1和T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Neu1,篩選到穩(wěn)定高表達(dá)Neu1的細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的粘附能力下降,而凋亡增強。此外同樣檢測了未做處理及TGF-β處理前后細(xì)胞中Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其中TLR3變化趨勢與Neu1一致,而過表達(dá)Neu1后,TLR3表達(dá)提高,其下游的NF-κB信號通路被激活。綜上所述,本文評估了Neu1的表達(dá)與膀胱癌腫瘤發(fā)展的相關(guān)性,Neu1的高表達(dá)可以降低膀胱癌細(xì)胞的增殖等能力以及對TLR3的表達(dá)及相關(guān)下游信號通路調(diào)控的影響,以期為膀胱癌的臨床診療開拓新思路并提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：唾液酸 Neu1 膀胱癌 Toll樣受體 信號通路
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 緒論8-16
• 1.1 糖生物學(xué)概述8-9
• 1.2 腫瘤細(xì)胞中糖鏈的異常唾液酸化修飾9-11
• 1.2.1 唾液酸9
• 1.2.2 異常唾液酸化與惡性腫瘤9
• 1.2.3 唾液酸轉(zhuǎn)移酶9-10
• 1.2.4 唾液酸酶10-11
• 1.3 Toll樣受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)11-13
• 1.3.1 Toll樣受體概述11-12
• 1.3.2 TLRs介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑12
• 1.3.3 NF-κB途徑12-13
• 1.4 常用的腫瘤細(xì)胞模型-上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型13-14
• 1.5 立題依據(jù)及意義14
• 1.6 主要研究內(nèi)容14-16
• 第二章 材料與方法16-24
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.1.1 菌株、細(xì)胞株與質(zhì)粒16
• 2.1.2 培養(yǎng)基16
• 2.1.3 主要試劑16-18
• 2.1.4 主要儀器18
• 2.2 實驗方法18-24
• 2.2.1 引物設(shè)計和目的基因的擴增18-20
• 2.2.2 NEU1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建20
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 2.2.4 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及陽性單克隆的篩選20-21
• 2.2.5 瞬時干擾21
• 2.2.6 實時熒光定量PCR21
• 2.2.7 蛋白免疫印跡法（Western blotting）21-22
• 2.2.8 MTT法檢測細(xì)胞增殖22
• 2.2.9 細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附實驗22
• 2.2.10 唾液酸酶活測定22
• 2.2.11 凝集素染色22-23
• 2.2.12 細(xì)胞免疫熒光23
• 2.2.13 細(xì)胞劃痕實驗23
• 2.2.14 流式細(xì)胞檢測23
• 2.2.15 免疫組化IHC23
• 2.2.16 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析處理23-24
• 第三章 結(jié)果與討論24-42
• 3.1 唾液酸酶Neu1與膀胱癌發(fā)展的相關(guān)性研究24-30
• 3.1.1 膀胱癌細(xì)胞中含唾液酸糖鏈及唾液酸酶酶活的測定24-25
• 3.1.2 唾液酸酶及唾液酸轉(zhuǎn)移酶在不同轉(zhuǎn)移潛能膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)25
• 3.1.3 唾液酸酶Neu1在不同膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)25-26
• 3.1.4 Neu1與膀胱癌患者病理的相關(guān)性研究26-30
• 3.1.5 小結(jié)30
• 3.2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程對Neu1表達(dá)影響30-34
• 3.2.1 TGF-β 誘導(dǎo)的EMT細(xì)胞模型構(gòu)建30-31
• 3.2.2 EMT發(fā)生后促進(jìn)細(xì)胞遷移31-32
• 3.2.3 EMT細(xì)胞模型中Sias表達(dá)水平研究32-33
• 3.2.4 EMT發(fā)生后細(xì)胞中Neu1的表達(dá)減少33-34
• 3.2.5 小結(jié)34
• 3.3 Neu1對膀胱癌細(xì)胞行為的影響及其作用機制研究34-42
• 3.3.1 過表達(dá)Neu1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的陽性篩選34-35
• 3.3.2 過表達(dá)Neu1對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響35-38
• 3.3.3 Toll樣受體（TLRs）在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)38
• 3.3.4 Neu1與Toll樣受體 3（TLR3）的表達(dá)關(guān)聯(lián)38-40
• 3.3.5 Neu1與TLR3的下游通路（NF-κB途徑）之間的關(guān)系40-41
• 3.3.6 小結(jié)41-42
• 主要結(jié)論與展望42-44
• 主要結(jié)論42
• 展望42-44
• 致謝44-45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 附錄： 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文50

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本文編號：1126092