本文關(guān)鍵詞：C3a分泌性表達(dá)載體及過(guò)表達(dá)C3a腎小管上皮細(xì)胞株的構(gòu)建

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【摘要】：目的已有的研究表明包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種腎病患者腎小管上皮細(xì)胞存在C3a/C3aR軸過(guò)度活化現(xiàn)象,但有關(guān)C3a/C3aR軸過(guò)度活化在腎小管上皮細(xì)胞中的病理意義未知。文中構(gòu)建分泌性過(guò)表達(dá)C3a的腎小腎小管上皮細(xì)胞株,為探討各種病理情況下C3a/C3aR軸過(guò)度活化的病理意義提供細(xì)胞模型。方法設(shè)計(jì)合成人C3a分泌性表達(dá)單元,將其克隆到慢病毒表達(dá)載體p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn),構(gòu)建成C3a分泌性表達(dá)載體p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;將p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,包裝成C3a表達(dá)重組慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人腎小管上皮細(xì)胞系HK2,根據(jù)LV-C3a上帶有殺稻瘟菌素抗性基因的特點(diǎn),以殺稻瘟菌素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆;利用熒光定量PCR和ELISA方法對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的C3a表達(dá)水平和分泌情況進(jìn)行分析,從中鑒定出穩(wěn)定分泌性過(guò)表達(dá)C3a的人腎小管上皮細(xì)胞株。結(jié)果 1成功構(gòu)建了序列完全正確的C3a分泌性表達(dá)載體p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功進(jìn)行了重組慢病毒包裝,得到了高滴度(5×108個(gè)/m L)的C3a表達(dá)重組慢病毒LV-C3a;3成功進(jìn)行了LV-C3a對(duì)HK2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LV-C3a的HK2細(xì)胞株;基于熒光定量PCR和ELISA的分析證實(shí),與HK2細(xì)胞比較,HK2-C3a細(xì)胞株中C3a mRNA表達(dá)水平顯著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P0.01],分泌的C3a水平顯著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P0.01]。結(jié)論成功構(gòu)建的C3a分泌性慢病毒表達(dá)載體和分泌性過(guò)表達(dá)C3a的人腎小管上皮細(xì)胞株為進(jìn)一步研究各種病理情景中C3a/C3aR過(guò)度活化在人腎小管上皮細(xì)胞中的病理意義提供了很好的細(xì)胞模型,也為進(jìn)一步開(kāi)展C3a/C3aR過(guò)度活化在其他細(xì)胞中的病理意義創(chuàng)造了條件。
【作者單位】： 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心全軍腎臟病研究所;南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科;
【關(guān)鍵詞】： Ca CaR 慢病毒 腎小管上皮細(xì)胞 過(guò)表達(dá)
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81370828)
【分類號(hào)】：R692
【正文快照】： 0引言補(bǔ)體系統(tǒng)的不適當(dāng)激活也會(huì)導(dǎo)致組織的損傷。越來(lái)越多的研究表明,補(bǔ)體系統(tǒng)參與了多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1-4]。補(bǔ)體活化與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種病變相關(guān)[5-7]。但有關(guān)補(bǔ)體系統(tǒng)參與糖尿病腎病等腎組織損傷的機(jī)制仍未明了。膜攻擊復(fù)合物的形成是各種補(bǔ)體活化通路

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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7 鐘城W，

本文編號(hào)：1028037