本文關(guān)鍵詞：腎移植受者HCMV感染與BAFF信號活化的相關(guān)性研究

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【摘要】：第一部分目的:研究腎移植受者人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染與B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF)信號的相關(guān)性。方法:①以來院隨訪的腎移植受者為研究對象,共采集113例患者抗凝外周血(EDTA-Na2抗凝)和尿液樣本。采用real-time PCR法檢測尿液中HCMV DNA水平。②應(yīng)用real-time PCR法檢測外周血單個核細(xì)胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信號和BAFF信號通路中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄本水平;PCR芯片技術(shù)對TLR信號通路、NF-κB信號通路,以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路中共88個基因進行研究,以篩選腎移植受者HCMV DNA陽性組和陰性組的差異表達基因。健康志愿者為對照。③ELISA法檢測血清s BAFF和總Ig G水平;間接熒光免疫試驗(IFA)檢測血清中抗HCMV pp65 Ig G、Ig M抗體水平,流式熒光法(Luminex)檢測血清抗人類白細(xì)胞抗原HLA抗體和抗MICA抗體水平(抗HLA-ⅠⅡMICA抗體)。④采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。兩個獨立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗;相關(guān)性分析采用Spearman法及Pearson法;P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:①113例來院隨訪腎移植病人中,尿HCMV DNA10,000拷貝/ml為12例,歸為陽性組;HCMV DNA10,000拷貝/ml的為83例,以及未出現(xiàn)擴增的18例,歸為陰性組。②ELISA結(jié)果顯示,陽性組患者血清s BAFF、總Ig G水平顯著高于陰性組(928±360 pg/ml vs 511±298 pg/ml,P0.05;26,260±15,960μg/ml vs 9,944±7,365μg/ml,P0.05);IFA結(jié)果顯示,陽性組患者血清抗HCMV pp65 Ig G水平顯著高于陰性組(P0.05);陽性組中尿HCMV DNA拷貝數(shù)與s BAFF呈正相關(guān)(r=0.988,P0.05),s BAFF與血清中總Ig G呈正相關(guān)(r=0.625,P0.05)。③Luminex檢測結(jié)果顯示,陽性組中抗HLA-ⅠⅡMICA抗體的陽性率為46.2%,陰性組為12.5%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。④real-time PCR發(fā)現(xiàn),與尿HCMV DNA陰性組比較,陽性組中文摘要腎移植受者HCMV感染與BAFF信號活化的相關(guān)性研究BAFF m RNA水平顯著增高(P0.05),其余分子(BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等)的表達未出現(xiàn)顯著差異;基因芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達差異基因共有46個,其中陽性組與陰性組相比較表達上調(diào)的基因有2個(BAFF-R、ICAM1),表達下調(diào)的基因22個(TLR-9、NLRC5、LIGHT等);陽性組與健康對照組相比較,表達上調(diào)的基因有2個(IFN-γ、ICAM1),表達下調(diào)的基因8個(CCL3L1、IL12B、ILIR1等);陰性組與健康對照組相比較表達上調(diào)的基因有11個(IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等),表達下調(diào)的基因1個(BAFF-R)。結(jié)論:腎移植受者HCMV感染后,HCMV-TLR信號活化可能引發(fā)或促進BAFF信號活化;HCMV-TLR信號與BAFF信號獨立或協(xié)作參與移植腎損傷。第二部分目的:體外探索HCMV-TLR9信號與BAFF信號串話的可能機制和效應(yīng)。方法:①HCMV感染HFL-1細(xì)胞,以無HCMV感染的HFL-1細(xì)胞作對照。在感染第1,3,5,7天時收獲細(xì)胞,提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同時相的表達水平變化。②HCMV直接感染人扁桃體B淋巴細(xì)胞,或以HCMV感染后的HFL-1細(xì)胞與扁桃體B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)第1,3,5,7天后收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清。流式分析各個時相B細(xì)胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BAFF-R+、TACI+、BCMA+的表達強度;ELISA檢測不同實驗分組細(xì)胞培養(yǎng)上清的Ig G分泌水平。另外,用5μg/ml Cp G ODN2006及其陰性對照,2.5μg/ml Cp G ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C),及200 ng/ml重組BAFF蛋白體外作用于B細(xì)胞作為對照。③采用中和性抗BAFF-R抗體在HCMV或Cp G ODN2006感染B細(xì)胞之前或之后阻抑BAFF信號,繼續(xù)培養(yǎng)5天,收集相應(yīng)的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清,分別用流式和ELISA檢測B細(xì)胞凋亡率和分泌Ig G水平,以分析HCMV感染、BAFF信號串話對B細(xì)胞生長及功能的影響;以HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨作用作為對照,以不加任何刺激劑作為空白對照。體外實驗用來分析HCMV感染對B細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。④采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行分析。兩個獨立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗;多組實驗間采用ANOVA方法進行兩兩比較;P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:①Western Blot結(jié)果顯示HCMV感染HFL-1細(xì)胞后,TLR9的表達水平隨感染時間先升高后下降,TRAF6和IRAK4則隨時間呈下降趨勢(時相間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義),NLRC5水平則未出現(xiàn)明顯變化;對照組中各蛋白表達水平隨時間均未出現(xiàn)明顯變化。②與HCMV感染的HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率在培養(yǎng)的第1-3天和第5-7天間出現(xiàn)顯著的上升,但在第0-1天、第3-5天之間則出現(xiàn)平臺期;與正常HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。HCMV直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率在第1-5天未出現(xiàn)明顯上升;Cp G ODN2006直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率在第0-1天下調(diào),第1-5天緩慢上調(diào);Cp G ODN2006 Control和rh BAFF直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率與不加任何制劑刺激相比無顯著差異;Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B細(xì)胞的凋亡率持續(xù)上升,且在相應(yīng)的時間點高于對照組;對照組中未用任何制劑刺激的B細(xì)胞早期凋亡率持續(xù)上升。③HCMV直接或間接感染B細(xì)胞,B細(xì)胞表面BAFF-R持續(xù)高水平表達;受rh BAFF和Cp G ODN2006刺激的B細(xì)胞BAFF-R表達水平與HCMV感染類似。Cp G ODN2006Control、Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激組和對照組中B細(xì)胞BAFF-R表達水平未出現(xiàn)明顯規(guī)律。B細(xì)胞表面BAFF及其受體TACI、BCMA的表達水平在各實驗組中均未發(fā)現(xiàn)明顯變化趨勢。④HCMV刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號,B細(xì)胞凋亡率上升,但Ig G分泌水平無顯著變化;Cp G ODN2006刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號,B細(xì)胞凋亡率顯著上升,Ig G分泌水平顯著下降;HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨刺激B細(xì)胞對其早期凋亡率無顯著影響,HCMV、Cp G ODN2006單獨刺激B細(xì)胞后B細(xì)胞Ig G分泌水平上調(diào)。結(jié)論:HCMV感染可在一定時間范圍內(nèi)增強HCMV-TLR9信號;HCMV-TLR9信號與BAFF信號串話,并在一定程度上抑制B細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R699.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 引言11-14
• 第一部分 腎移植受者HCMV感染與BAFF信號活化的相關(guān)性分析14-29
• 1 材料與方法14-21
• 2 結(jié)果21-26
• 3 討論26-29
• 第二部分HCMV體外感染人胚肺成纖維細(xì)胞及其對人B淋巴細(xì)胞的作用機制研究29-46
• 1 材料與方法29-33
• 2 結(jié)果33-43
• 3 討論43-46
• 參考文獻46-52
• 綜述52-60
• 參考文獻55-60
• 中英文縮略詞表60-62
• 攻讀研究生期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63-65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周亮;陸兵勛;尹恝;;細(xì)胞色素CYP2D6基因多態(tài)性與海洛因海綿狀白質(zhì)腦病易感性的關(guān)系[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年03期

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本文編號：1025894