本文關(guān)鍵詞：腎移植受者HCMV感染與BAFF信號(hào)活化的相關(guān)性研究

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【摘要】：第一部分目的:研究腎移植受者人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染與B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF)信號(hào)的相關(guān)性。方法:①以來(lái)院隨訪的腎移植受者為研究對(duì)象,共采集113例患者抗凝外周血(EDTA-Na2抗凝)和尿液樣本。采用real-time PCR法檢測(cè)尿液中HCMV DNA水平。②應(yīng)用real-time PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信號(hào)和BAFF信號(hào)通路中相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄本水平;PCR芯片技術(shù)對(duì)TLR信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路,以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體通路中共88個(gè)基因進(jìn)行研究,以篩選腎移植受者HCMV DNA陽(yáng)性組和陰性組的差異表達(dá)基因。健康志愿者為對(duì)照。③ELISA法檢測(cè)血清s BAFF和總Ig G水平;間接熒光免疫試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)血清中抗HCMV pp65 Ig G、Ig M抗體水平,流式熒光法(Luminex)檢測(cè)血清抗人類白細(xì)胞抗原HLA抗體和抗MICA抗體水平(抗HLA-ⅠⅡMICA抗體)。④采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman法及Pearson法;P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:①113例來(lái)院隨訪腎移植病人中,尿HCMV DNA10,000拷貝/ml為12例,歸為陽(yáng)性組;HCMV DNA10,000拷貝/ml的為83例,以及未出現(xiàn)擴(kuò)增的18例,歸為陰性組。②ELISA結(jié)果顯示,陽(yáng)性組患者血清s BAFF、總Ig G水平顯著高于陰性組(928±360 pg/ml vs 511±298 pg/ml,P0.05;26,260±15,960μg/ml vs 9,944±7,365μg/ml,P0.05);IFA結(jié)果顯示,陽(yáng)性組患者血清抗HCMV pp65 Ig G水平顯著高于陰性組(P0.05);陽(yáng)性組中尿HCMV DNA拷貝數(shù)與s BAFF呈正相關(guān)(r=0.988,P0.05),s BAFF與血清中總Ig G呈正相關(guān)(r=0.625,P0.05)。③Luminex檢測(cè)結(jié)果顯示,陽(yáng)性組中抗HLA-ⅠⅡMICA抗體的陽(yáng)性率為46.2%,陰性組為12.5%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④real-time PCR發(fā)現(xiàn),與尿HCMV DNA陰性組比較,陽(yáng)性組中文摘要腎移植受者HCMV感染與BAFF信號(hào)活化的相關(guān)性研究BAFF m RNA水平顯著增高(P0.05),其余分子(BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等)的表達(dá)未出現(xiàn)顯著差異;基因芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達(dá)差異基因共有46個(gè),其中陽(yáng)性組與陰性組相比較表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè)(BAFF-R、ICAM1),表達(dá)下調(diào)的基因22個(gè)(TLR-9、NLRC5、LIGHT等);陽(yáng)性組與健康對(duì)照組相比較,表達(dá)上調(diào)的基因有2個(gè)(IFN-γ、ICAM1),表達(dá)下調(diào)的基因8個(gè)(CCL3L1、IL12B、ILIR1等);陰性組與健康對(duì)照組相比較表達(dá)上調(diào)的基因有11個(gè)(IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等),表達(dá)下調(diào)的基因1個(gè)(BAFF-R)。結(jié)論:腎移植受者HCMV感染后,HCMV-TLR信號(hào)活化可能引發(fā)或促進(jìn)BAFF信號(hào)活化;HCMV-TLR信號(hào)與BAFF信號(hào)獨(dú)立或協(xié)作參與移植腎損傷。第二部分目的:體外探索HCMV-TLR9信號(hào)與BAFF信號(hào)串話的可能機(jī)制和效應(yīng)。方法:①HCMV感染HFL-1細(xì)胞,以無(wú)HCMV感染的HFL-1細(xì)胞作對(duì)照。在感染第1,3,5,7天時(shí)收獲細(xì)胞,提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同時(shí)相的表達(dá)水平變化。②HCMV直接感染人扁桃體B淋巴細(xì)胞,或以HCMV感染后的HFL-1細(xì)胞與扁桃體B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)第1,3,5,7天后收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清。流式分析各個(gè)時(shí)相B細(xì)胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BAFF-R+、TACI+、BCMA+的表達(dá)強(qiáng)度;ELISA檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞培養(yǎng)上清的Ig G分泌水平。另外,用5μg/ml Cp G ODN2006及其陰性對(duì)照,2.5μg/ml Cp G ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C),及200 ng/ml重組BAFF蛋白體外作用于B細(xì)胞作為對(duì)照。③采用中和性抗BAFF-R抗體在HCMV或Cp G ODN2006感染B細(xì)胞之前或之后阻抑BAFF信號(hào),繼續(xù)培養(yǎng)5天,收集相應(yīng)的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清,分別用流式和ELISA檢測(cè)B細(xì)胞凋亡率和分泌Ig G水平,以分析HCMV感染、BAFF信號(hào)串話對(duì)B細(xì)胞生長(zhǎng)及功能的影響;以HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨(dú)作用作為對(duì)照,以不加任何刺激劑作為空白對(duì)照。體外實(shí)驗(yàn)用來(lái)分析HCMV感染對(duì)B細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。④采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn);多組實(shí)驗(yàn)間采用ANOVA方法進(jìn)行兩兩比較;P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:①Western Blot結(jié)果顯示HCMV感染HFL-1細(xì)胞后,TLR9的表達(dá)水平隨感染時(shí)間先升高后下降,TRAF6和IRAK4則隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)(時(shí)相間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),NLRC5水平則未出現(xiàn)明顯變化;對(duì)照組中各蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間均未出現(xiàn)明顯變化。②與HCMV感染的HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率在培養(yǎng)的第1-3天和第5-7天間出現(xiàn)顯著的上升,但在第0-1天、第3-5天之間則出現(xiàn)平臺(tái)期;與正常HFL-1細(xì)胞共培養(yǎng)的B細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。HCMV直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率在第1-5天未出現(xiàn)明顯上升;Cp G ODN2006直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率在第0-1天下調(diào),第1-5天緩慢上調(diào);Cp G ODN2006 Control和rh BAFF直接刺激B細(xì)胞,B細(xì)胞的早期凋亡率與不加任何制劑刺激相比無(wú)顯著差異;Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B細(xì)胞的凋亡率持續(xù)上升,且在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)高于對(duì)照組;對(duì)照組中未用任何制劑刺激的B細(xì)胞早期凋亡率持續(xù)上升。③HCMV直接或間接感染B細(xì)胞,B細(xì)胞表面BAFF-R持續(xù)高水平表達(dá);受rh BAFF和Cp G ODN2006刺激的B細(xì)胞BAFF-R表達(dá)水平與HCMV感染類似。Cp G ODN2006Control、Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激組和對(duì)照組中B細(xì)胞BAFF-R表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯規(guī)律。B細(xì)胞表面BAFF及其受體TACI、BCMA的表達(dá)水平在各實(shí)驗(yàn)組中均未發(fā)現(xiàn)明顯變化趨勢(shì)。④HCMV刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號(hào),B細(xì)胞凋亡率上升,但I(xiàn)g G分泌水平無(wú)顯著變化;Cp G ODN2006刺激B細(xì)胞之前阻抑BAFF信號(hào),B細(xì)胞凋亡率顯著上升,Ig G分泌水平顯著下降;HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗體單獨(dú)刺激B細(xì)胞對(duì)其早期凋亡率無(wú)顯著影響,HCMV、Cp G ODN2006單獨(dú)刺激B細(xì)胞后B細(xì)胞Ig G分泌水平上調(diào)。結(jié)論:HCMV感染可在一定時(shí)間范圍內(nèi)增強(qiáng)HCMV-TLR9信號(hào);HCMV-TLR9信號(hào)與BAFF信號(hào)串話,并在一定程度上抑制B細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R699.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 引言11-14
• 第一部分 腎移植受者HCMV感染與BAFF信號(hào)活化的相關(guān)性分析14-29
• 1 材料與方法14-21
• 2 結(jié)果21-26
• 3 討論26-29
• 第二部分HCMV體外感染人胚肺成纖維細(xì)胞及其對(duì)人B淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制研究29-46
• 1 材料與方法29-33
• 2 結(jié)果33-43
• 3 討論43-46
• 參考文獻(xiàn)46-52
• 綜述52-60
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 中英文縮略詞表60-62
• 攻讀研究生期間發(fā)表論文62-63
• 致謝63-65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 周亮;陸兵勛;尹恝;;細(xì)胞色素CYP2D6基因多態(tài)性與海洛因海綿狀白質(zhì)腦病易感性的關(guān)系[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

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本文編號(hào)：1025894