本文關(guān)鍵詞：Fscb基因敲除對雄性小鼠生殖功能的影響研究

  更多相關(guān)文章： 基因敲除 CRISPR/Cas9 動物模型 FSCB 生殖力

【摘要】：研究背景:近年來,隨著環(huán)境污染、遺傳和生活習(xí)慣的改變等因素的影響下,男性不育發(fā)病率呈上升趨勢[1]。精子形成過程中睪丸特異性基因的適時有序表達,并驅(qū)動精子各細胞器的協(xié)調(diào)合成和裝配,精子鞭毛骨架結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白的有序轉(zhuǎn)運整合是保證精子發(fā)揮正常功能的根本物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)嚴重弱精癥或精子完全無運動的患者存在精子纖維鞘發(fā)育不良[6]。纖維鞘鈣結(jié)合蛋白(Fibrous Sheath Calcium-binding protein,FSCB)是李彥鋒教授首先發(fā)現(xiàn)并鑒定的,在精子形成過程中特異性表達并最終定位于精子鞭毛纖維鞘的環(huán)狀肋板和縱形柱狀體表面上的一種新蛋白[7]。該蛋白具有睪丸/精子特異性,僅在減數(shù)分裂后的精子形成后期階段表達。前期研究[14]證實:FSCB,CABYR等蛋白可能通過直接或間接的相互作用結(jié)合裝配于纖維鞘的支架蛋白AKAPs上,形成巨分子蛋白復(fù)合物,共同發(fā)揮纖維鞘的生理功能。FSCB蛋白具有保守的PXXP基序,伸展蛋白樣區(qū)域和脯氨酸富積區(qū),同時具有鈣結(jié)合能力,并且其絲氨酸/蘇氨酸在體內(nèi)外均可被蛋白激酶A(PKA)磷酸化。因此,推斷該蛋白可能是一種參與精子鞭毛運動,與精子獲能和超活化作用有關(guān)的重要蛋白[7]。在精子形成過程中,FSCB蛋白定位特征和表達的時相分析研究顯示,該蛋白與纖維鞘的主要結(jié)構(gòu)蛋白AKAP4的表達具有高度相似性。AKAP4豐富表達于發(fā)育階段精子纖維鞘內(nèi),為蛋白酶和多種激酶提供支架。應(yīng)用基因敲除小鼠的研究證實:Akap4 / 純合子雄鼠產(chǎn)生的精子數(shù)量雖然正常,但存在纖維鞘形成缺陷,表現(xiàn)為稀薄的環(huán)狀肋板和縮短的柱狀體,同時精子喪失前向運動而表現(xiàn)為不育[13]。為進一步了解FSCB蛋白在精子形成和精子運動中的功能,本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建鼠Fscb基因打靶載體,敲除Fscb基因全長,建立Fscb基因敲除動物模型。應(yīng)用精子質(zhì)量和運動分析,體內(nèi)外授精分析,Western blot,免疫組化等鑒定Fscb基因敲除小鼠的表型特征,從而深入研究了Fscb基因缺失對雄鼠生育能力的影響。第一部分:鼠Fscb基因靶向敲除載體的構(gòu)建及動物模型的建立目的構(gòu)建sg RNA載體,建立敲除Fscb基因的動物模型。方法根據(jù)鼠fscb基因序列,設(shè)計3對針對fscb基因的向?qū)na寡聚核苷酸鏈;將3對fscbsgrna寡核苷酸單鏈以逐步降溫的方法退火成雙鏈,然后分別與線性化的puc57-t7-gdna質(zhì)粒進行連接,連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,菌液提取質(zhì)粒dna,通過pcr測序鑒定,獲得sgrna表達質(zhì)粒。sgrna的表達質(zhì)粒和cas9質(zhì)粒都經(jīng)酶切線性化,利用t7rna聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄好的sgrna和cas9mrna混合并調(diào)整至合適濃度,通過顯微注射法將rna混合物注射到b6j鼠受精卵中,注射后立即移植進b6j假孕受體鼠,獲得fscb基因敲除的初建鼠(f0)。剪取鼠尾提取dna,通過pcr鑒定,選取靶基因敲除的小鼠進行傳代,進一步通過ta克隆、測序檢查確定突變。結(jié)果成功構(gòu)建表達puc57-t7-gdna-sgrna的載體,利用t7rna聚合酶將sgrna的表達質(zhì)粒和cas9質(zhì)粒在體外順利完成轉(zhuǎn)錄。將有活性的cas9rna和sgrna混合物直接顯微注射入b6j鼠受精卵,獲得f0代39只陽性小鼠,選取3只明確刪除fscb基因雄鼠與野生雌鼠交配,獲得f1代2雄3雌共5只陽性小鼠,將f1代雜合子雄鼠與雌鼠交配,獲得純合子小鼠。通過鑒定,成功構(gòu)建兩種不同基因型的fscb基因敲除鼠系,并傳代繁育。westernblot分析證實純合子雄鼠睪丸及精子內(nèi)的fscb蛋白表達消失。結(jié)論通過crispr/cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建表達sgrna的載體,獲得靶向敲除fscb基因純合子小鼠,并成功建立了下一步分析fscb蛋白功能的基因敲除模型鼠系。第二部分fscb基因敲除對雄性小鼠生殖功能的影響目的利用fscb基因敲除小鼠,探討fscb基因表達缺失對雄性小鼠生殖功能的影響。方法應(yīng)用免疫熒光觀察fscb基因敲除后小鼠睪丸組織及精子中fscb蛋白表達情況;應(yīng)用計算機輔助分析小鼠精子在體外獲能前后的精子運動特征、存活率和運動參數(shù)及單個精子運動軌跡;在體外獲能培養(yǎng)條件下檢測精子的體外受精能力;將fscb基因敲除純合子(ko)、雜合子(het)、野生型(wt)雄鼠分別與野生型c57bl/6j成年雌鼠交配,觀察雌鼠懷孕率,懷孕胚胎數(shù)量,自然產(chǎn)仔數(shù)及子代成年雄鼠生殖腺形態(tài)學(xué)是否存在差異。結(jié)果免疫熒光觀察顯示純合子小鼠睪丸組織及精子中均無fscb蛋白表達,雜合子小鼠睪丸組織及精子中fscb蛋白表達與野生型相比明顯減低,與預(yù)期結(jié)果相符。野生型、雜合子和純合子小鼠精子的存活率、各項運動參數(shù)均無顯著差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),精子形態(tài)和單個精子運動軌跡等也無明顯差異;體外受精實驗顯示:各組雄鼠精子與透明帶結(jié)合的平均數(shù)、透明帶完整卵細胞的授精率、與無透明帶卵結(jié)合的精子平均數(shù)均無差異(P均0.05)。受精能力分析研究顯示,野生型、雜合子與純合子雄鼠所對應(yīng)的交配雌鼠的受孕率,懷孕胚胎數(shù)、自然產(chǎn)仔數(shù),各組間均無顯著差別(P0.05),各組子代成年雄鼠生殖腺發(fā)育也無明顯差異。結(jié)論精子形成相關(guān)基因Fscb在精子形成過程中特異性表達,并定位于精子尾部的纖維鞘上。Fscb基因敲除后,雄性小鼠精子的運動功能及體內(nèi)外受精能力無明顯變化,表明該基因所編碼的蛋白的功能對于精子運動和授精能力的維持可能是非必需的或可被替代的。
【關(guān)鍵詞】：基因敲除 CRISPR/Cas9 動物模型 FSCB 生殖力
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R698.2
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 鼠Fscb基因靶向敲除載體的構(gòu)建及動物模型的建立17-31
• 2.1 材料與方法17-24
• 2.2 結(jié)果24-29
• 2.3 討論29-31
• 第三章 Fscb基因敲除對雄鼠生殖功能的影響研究31-48
• 3.1 材料與方法31-36
• 3.2 結(jié)果36-44
• 3.3 討論44-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻49-54
• 文獻綜述 精子形成相關(guān)基因及蛋白功能研究進展54-67
• 參考文獻61-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文67-68
• 致謝68

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉德培，方福德，，梁植權(quán);基因敲除[J];生理科學(xué)進展;1995年01期

2 賀松;張德純;;基因敲除方法及其應(yīng)用[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2009年02期

3 黃P;胡芳;曾祥云;;基因敲除模型技術(shù)及其在眼科研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];眼科新進展;2011年03期

4 葉真龍;王艷;金華君;劉韜;錢其軍;;延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除大鼠胚胎干細胞株的建立[J];中國組織工程研究;2013年01期

5 方福德;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所基因敲除中心成立并開始工作[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2001年03期

6 王景;穆媛媛;黎庶;陳志瑾;熊坤;叢延廣;;革蘭陰性菌基因敲除載體的構(gòu)建及其應(yīng)用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2009年23期

7 潘曉華;王宇罡;張戈;劉鐘;曾萬程;陳嘉凱;戴勇;秦嶺;;ERβ基因敲除小鼠的繁殖、鑒定及檢測[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年01期

8 郭敏利;樸永哲;王世全;黃瑋;周華成;楊洪澤;唐麗娜;;丙酸桿菌基因敲除體系的構(gòu)建及其應(yīng)用[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2013年07期

9 雷立芳;李大力;周軍媚;葉湘漓;;BAI1基因敲除打靶載體的快速構(gòu)建[J];生命科學(xué)研究;2012年02期

10 顧星星;陶慧;;Jagged1基因敲除小鼠血管內(nèi)皮發(fā)育異常[J];交通醫(yī)學(xué);2006年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賀松;張德純;;基因敲除方法及其應(yīng)用[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會2009年論文集[C];2009年

2 王景;穆媛媛;黎庶;陳志瑾;熊坤;叢延廣;;革蘭陰性菌基因敲除載體的構(gòu)建及其應(yīng)用[A];重慶微生物學(xué)會第九屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2009年

3 孟凡偉;;利用基因敲除研究小鼠Dapper2基因的功能[A];中國遺傳學(xué)會模式生物與人類健康研討會會議論文集[C];2010年

4 黃黎珍;顧為望;;利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)基因敲除豬的研究[A];第九屆中國實驗動物科學(xué)年會（2010新疆）論文集[C];2010年

5 隋聰;熊承良;沈士亮;;敲除Attractin或Mahoganoid基因?qū)π坌孕∈笊硟?nèi)分泌激素的影響[A];湘鄂贛首屆性與生殖健康學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2007年

6 師福山;趙德明;;朊蛋白受體基因敲除的打靶載體構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010年學(xué)術(shù)年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

7 李志杰;丁壯;;基因敲除及其在動物疾病上的研究應(yīng)用[A];第六屆全國會員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集（上）[C];2005年

8 周晴晴;閆紅霞;金戈;康巧珍;;蛋白4.1R基因敲除對小鼠T細胞的影響[A];第九屆中國實驗動物科學(xué)年會（2010新疆）論文集[C];2010年

9 林蜜蜜;尹芙蓉;金暢;瞿佳;;LGR4基因敲除成年鼠眼表型研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二屆全國眼科學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2007年

10 路福平;田琳;;分枝桿菌甾酮C_(1,2)位脫氫酶的基因敲除[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 李e灞頸ㄊ迪凹欽

本文編號：1021995