本文關(guān)鍵詞：血小板源性生長(zhǎng)因子BB下調(diào)myocardin在低氧誘導(dǎo)的大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用

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【摘要】：背景和目的勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)是常見的泌尿男科疾病,特別是45歲以上的男性患ED的風(fēng)險(xiǎn)性明顯增高。導(dǎo)致ED的病因包括許多方面,如血管、神經(jīng)、心理、內(nèi)分泌等,近年來,血管因素越來越受到醫(yī)生和患者的重視。陰莖海綿體與血管系統(tǒng)具有很多相似性,被認(rèn)為是一種特殊的血管類組織。陰莖海綿體平滑肌(CCSM)是海綿竇間隙舒張及陰莖勃起的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在正常陰莖勃起的血流動(dòng)力學(xué)變化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,同時(shí)CCSM為各種因素作用的終末組織,處于重要的核心地位。任何引起CCSM組織或細(xì)胞損傷的因素均可能導(dǎo)致患者ED的發(fā)生。CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可以改變海綿體的正常結(jié)構(gòu)和功能,與ED的發(fā)生密切相關(guān)。平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是指：機(jī)體發(fā)育的不同階段或不同疾病狀態(tài)下平滑肌細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的改變。CCSM細(xì)胞同血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)有相似性,分為收縮型和合成型兩種類型,并能根據(jù)細(xì)胞的局部環(huán)境變化重塑其表型,具有雙向分化功能。CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可改變細(xì)胞的收縮和舒張能力,并且使其合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力增加,促進(jìn)海綿體纖維化,進(jìn)而引起陰莖海綿體血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,在器質(zhì)性ED的發(fā)生發(fā)展過程中起非常重要的病理生理作用。在眾多可引起陰莖海綿體結(jié)構(gòu)和功能改變的因素中,低氧容易被人們所忽視。低氧是指組織對(duì)氧的供求比例失調(diào),氧供量減少,不足以維持組織的代謝、功能和結(jié)構(gòu)的需要。低氧在各種病因引起的器質(zhì)性ED過程中普遍存在,如糖尿病、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Sleep Apnea Hypopnea Syndrome, SAHS)、前列腺癌根治術(shù)后神經(jīng)血管束損傷、高原性低氧等；并且陰莖海綿體組織在疲軟狀態(tài)下本就處于低氧環(huán)境中,而是通過夜間勃起或者性興奮勃起增加海綿體血流來改善陰莖海綿體的缺氧狀態(tài),避免其長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境中來維持良好的陰莖勃起功能。長(zhǎng)期低氧可改變陰莖海綿體的結(jié)構(gòu)和功能,甚至導(dǎo)致海綿體纖維化。可見,慢性低氧在器質(zhì)性ED的發(fā)生中起非常重要的作用。但是,低氧能否導(dǎo)致CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及其具體的分子機(jī)制目前尚不清楚。血小板源性生長(zhǎng)因子BB (PDGFB B)屬于PDGF家族,是體內(nèi)一種主要的促有絲分裂劑。在局部組織缺血缺氧、炎癥等許多病理生理情況下,可由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及許多腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。PDGFBB結(jié)合PDGF受體并使其磷酸化,活化下游重要的信號(hào)分子,參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如ras/GTP, PI3K, Src, MAPK等,在動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈再狹窄等心血管疾病中起非常重要的作用。PDGFBB能下調(diào)VSMC中myocardin的表達(dá),使其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。而我們前期研究表明,myocardin在CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程中也起關(guān)鍵作用,糖尿病性ED的大鼠陰莖海綿體中的myocardin明顯下降,并且陰莖海綿體過表達(dá)myocardin能夠逆轉(zhuǎn)CCSM細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化和改善糖尿病性ED大鼠的勃起功能。綜上所述,我們推想：PDGFBB下調(diào)myocardin可能在低氧誘導(dǎo)CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程中起重要作用。盡管近年來,PDGFBB在心血管系統(tǒng)疾病方面被研究得比較深入,然而低氧能否促進(jìn)CCSM細(xì)胞分泌PDGFBB,后者能否下調(diào)CCSM細(xì)胞中的myocardin表達(dá)水平并誘導(dǎo)其表型轉(zhuǎn)化,目前尚不清楚。本研究分別通過在低氧條件下及重組PDGFBB刺激下培養(yǎng)CCSM細(xì)胞,觀察低氧對(duì)CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和CCSM細(xì)胞分泌PDGFBB的影響,以及PDGFBB對(duì)CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞中myocardin表達(dá)水平的影響,進(jìn)而了解低氧誘導(dǎo)的CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要分子機(jī)制,為勃起功能障礙的治療提供理論基礎(chǔ)。方法1.大鼠CCSM細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定。采用改良組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)大鼠CCSM細(xì)胞,傳代培養(yǎng)時(shí)進(jìn)一步用差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化,從而篩選出高純度的CCSM細(xì)胞,然后用平滑肌α肌動(dòng)蛋白(a-SMA)和平滑肌細(xì)胞分化特異性抗原(smoothelin)細(xì)胞免疫熒光法鑒定細(xì)胞類型。2.低氧對(duì)大鼠CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及CCSM細(xì)胞分泌PDGFBB的影響。取生物學(xué)性狀相對(duì)較穩(wěn)定的第二代CCSM細(xì)胞,將低氧組細(xì)胞置于2.5%氧濃度的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h和48h,而陰性對(duì)照組細(xì)胞置于正常氧濃度的5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h和48h,分別收集24h和48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液,利用qRT-PCR檢測(cè)CCSM細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子1nyocardin及收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、SMMHC和smoothelin的mRNA表達(dá)水平；用westernblotting檢測(cè)CCSM細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子myocardin的蛋白表達(dá)水平。用Elisa法檢測(cè)CCSM細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子PDGFBB的表達(dá)水平。3. PDGFBB對(duì)大鼠CCSM細(xì)胞增殖活性、遷移能力及表型轉(zhuǎn)化的影響。取第二代CCSM細(xì)胞,用不同濃度的重組PDGFBB來刺激CCSM細(xì)胞,利用CCK-8法檢測(cè)各濃度的PDGFBB對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠CCSM細(xì)胞增殖活性的影響,并篩選出作用于CCSM細(xì)胞的最適PDGFBB濃度。用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)最適濃度的PDGFBB對(duì) CCSM細(xì)胞遷移能力的影響。然后分別用Ong/ml的PDGFBB與最適濃度的PDGFBB處理CCSM細(xì)胞24h和48h,利用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子myocardin及收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、SMMHC mRNA表達(dá)水平；用最適濃度的PDGFBB處理CCSM細(xì)胞0、24和48h后,利用western blotting檢測(cè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子myocardin的蛋白表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,兩組間差異的比較用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組的比較采用Dunnett法,組間多重比較采用LSD法。P0.05表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.大鼠CCSM細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果。倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),原代第4～5d時(shí)有少數(shù)梭形細(xì)胞從組織塊邊緣游出逐漸形成細(xì)胞暈,至22d左右細(xì)胞長(zhǎng)滿覆蓋培養(yǎng)瓶底；傳代并經(jīng)差速貼壁離心法篩選后的細(xì)胞絕大部分呈梭形,呈方向性排列,少部分呈星形。生長(zhǎng)密集時(shí)細(xì)胞呈典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)或者排列呈旋渦狀。CCSM細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),視野內(nèi)細(xì)胞呈梭形或者星形,所有細(xì)胞核均呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,約97%細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光為α-SMA陽性,約96.5%的細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)為紅色熒光為smoothelin陽性即CCSM細(xì)胞。2.低氧可下調(diào)大鼠CCSM細(xì)胞中myocardin和收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、 SMMHCC和smoothelin的表達(dá)水平。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,24h和48h時(shí)低氧組CCSM細(xì)胞中myocardin mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P均0.001); α-SMA mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P均0001); SMMHC mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(24h P0.001,48h P 0.05); smoothelin mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(24h P0.001,48hP0.01)。western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,24h和48h時(shí)低氧組CCSM細(xì)胞中myocardin蛋白表達(dá)均減少(P均0.05)。可見,低氧能下調(diào)CCSM細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子myocardin及收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、SMMHC和smoothelin的表達(dá),進(jìn)而說明低氧可誘導(dǎo)CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。3.低氧能促進(jìn)大鼠CCSM細(xì)胞分泌PDGFBB。用Elisa法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子PDGFBB的含量,結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比,24h和48h時(shí)低氧組CCSM細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PDGFBB表達(dá)均明顯增加(P均0.05)。4. PDGFBB顯著增強(qiáng)CCSM細(xì)胞增殖活性和遷移能力,PDGFBB作用于CCSM細(xì)胞的最適濃度為12.5ng/ml。PDGFBB對(duì)CCSM細(xì)胞增殖活性的影響：分別采用終濃度為0、2.5、5.0、12.5及25.0ng/ml的重組PDGFBB刺激體外培養(yǎng)的大鼠CCSM細(xì)胞,24h和48h時(shí)用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況,結(jié)果(OD值)顯示,在24h和48h時(shí),與陰性對(duì)照組(Ong/ml PDGFBB)相比,各不同濃度的PDGFBB均能明顯刺激大鼠CCSM細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(各濃度24h和48h時(shí)P值均為P0.001)。且在終濃度為12.5ng/ml時(shí),PDGFB B對(duì)CCSM細(xì)胞的促增殖作用最明顯,由此我們篩選出PDGFBB作用于CCSM細(xì)胞的最適濃度為12.5ng/ml。PDGFBB對(duì)CCSM細(xì)胞遷移能力的影響：利用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),分別采用Ong/ml及12.5ng/ml的PDGFBB來誘導(dǎo)CCSM細(xì)胞遷移,結(jié)果顯示,在12h和24h時(shí),與陰性對(duì)照組相比,PDGFBB能明顯增強(qiáng)CCSM細(xì)胞的遷移能力。5.PDGFBB顯著下調(diào)CCSM細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子myocardin的表達(dá)水平和收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、SMMHC的表達(dá)水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較,24h和48h時(shí)PDGFBB組CCSM細(xì)胞中myocardin mRNA表達(dá)分別下降45%、66%；α-SMA mRNA表達(dá)分別下降28%、50%; SMMHC mRNA表達(dá)分別下降44%、58%�？梢�,PDGFBB能下調(diào)CCSM細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子myocardin及收縮型表型標(biāo)志物α-SMA、SMMHC的表達(dá),進(jìn)而說明PDGFBB可促進(jìn)CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與0h相比,PDGFBB刺激CCSM細(xì)胞24h時(shí),細(xì)胞中myocardin蛋白表達(dá)減少(P0.001)；與0h相比,PDGFB B刺激CCSM細(xì)胞48h時(shí),CCSM細(xì)胞中myocardin蛋白表達(dá)顯著減少(P0.001)；說明在48h內(nèi)細(xì)胞中myocardin蛋白表達(dá)水平隨著PDGFBB作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低�？梢�,PDGFBB可能是通過下調(diào)myocardin表達(dá)來引起CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的。結(jié)論1.改良的組織塊培養(yǎng)法和差速貼壁離心法可獲得較純的CCSM細(xì)胞。2.低氧可誘導(dǎo)大鼠CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。3.低氧能促進(jìn)大鼠CCSM細(xì)胞分泌PDGFBB。4.PDGFBB顯著增強(qiáng)CCSM細(xì)胞增殖活性和遷移能力；其最適終濃度為12.5ng/ml。5.PDGFBB可促進(jìn)CCSM細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,其機(jī)制可能是通過下調(diào)myocardin來起作用的。6.綜合上述,我們得出：PDGFBB下調(diào)myocardin在低氧誘導(dǎo)的大鼠CCSM細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 低氧 血小板源性生長(zhǎng)因子BB myocardin
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R698
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 第一章 低氧對(duì)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和分泌PDGFBB的影響23-42
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料23-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-36
• 3. 結(jié)果和附圖36-42
• 第二章 PDGFBB下調(diào)MYOCARDIN在大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用42-57
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料42-45
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法45-53
• 3. 結(jié)果和附圖53-57
• 第三章 討論57-62
• 第四章 全文小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-72
• 縮寫詞簡(jiǎn)表72-73
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況73-74
• 致謝74-75

【共引文獻(xiàn)】

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3 劉樹輝;中藥復(fù)方治療抗精子抗體陽性免疫性不孕癥的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年

4 趙志亮;黃芪多糖對(duì)VC大鼠血中CO濃度及睪丸微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2010年

5 李廣森;勃起功能障礙不同中醫(yī)證型與體質(zhì)類型相關(guān)性研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2010年

6 陳海;黃芪多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張大鼠HO-1/CO系統(tǒng)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2010年

7 唐喜;單用文拉法辛及聯(lián)合利多卡因膠漿治療原發(fā)性早泄的臨床研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

8 韓智超;男性不育癥中醫(yī)證候?qū)W規(guī)律研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2011年

9 張俊;黃精贊育膠囊治療腎精虧虛型特發(fā)性畸形精子癥的臨床觀察[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

10 江洪亮;補(bǔ)腎填精方治療腎虛精虧型特發(fā)性少精、弱精不育的臨床觀察[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：1009185