發(fā)布時間：2017-10-10 21:03

  本文關鍵詞：女性特異性膀胱癌相關基因及其共表達網(wǎng)絡分析

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【摘要】：背景膀胱癌是指發(fā)生在膀胱粘膜上的惡性腫瘤,其分類很多包括膀胱尿路上皮癌,膀胱腺癌、膀胱鱗狀細胞癌等。通常我們所說的膀胱癌是指膀胱尿路上皮細胞癌,這種癌癥占膀胱癌患者的90%。膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,而在西方其在泌尿系統(tǒng)相關腫瘤中的發(fā)病率僅次于前列腺癌。在美國僅2015年就有7.4萬膀胱癌新生病例,占所有癌癥新生病例的4.5%。根據(jù)美國國家癌癥研究所的統(tǒng)計,2015年美國全境有超過1.6萬人死于膀胱癌,占由癌癥引起的死亡人數(shù)的2.7%。2007-2012年在美國膀胱癌的五年生存率僅為77%。通常膀胱癌的發(fā)病率會隨著年齡的增加而增加,其中50-70段年齡層的人口發(fā)病率最高,并且其在男性中的發(fā)病率遠高于女性。全世界范圍內(nèi),男性膀胱癌年齡標化的發(fā)病率為9.0/10萬(居所有惡性腫瘤第七),女性年齡標化的發(fā)病率為2.2/10萬(居所有惡性腫瘤第十八)。膀胱癌的發(fā)病率在發(fā)達國家(男性發(fā)病率16.6/10萬,女性發(fā)病率3.6/10萬)高于發(fā)展中國家(男性發(fā)病率5.4/10萬,女性發(fā)病率1.4/10萬)及欠發(fā)達國家(男性發(fā)病率1.5/10萬,女性發(fā)病率0.3/10萬)。其中歐洲及北美的膀胱癌被認為是膀胱癌高發(fā)地區(qū),其男性年齡標化的發(fā)病率為20/10萬,女性年齡標化的發(fā)病率為5/10萬,有研究顯示近年來這些地區(qū)女性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率有輕微的降低,男性膀胱癌的發(fā)病率在減少而死亡率也趨于穩(wěn)定。在我國,膀胱癌在男性中年齡標準化的發(fā)病率為7.37/10萬,對于女性其年齡標化的發(fā)病率為1.98/10萬處于中等水平。但是,由于社會的發(fā)展工業(yè)化以及人口老齡化等原因,膀胱癌在中國的發(fā)病狀況不容樂觀。有統(tǒng)計顯示,近十年來在國內(nèi)不論是在男性還是女性,農(nóng)村還是城市,發(fā)病率均呈逐年增長的趨勢。膀胱癌的發(fā)生是一個比較復雜的過程,既與環(huán)境因素相關也與遺傳因素相關。其中吸煙被認為是導致膀胱癌發(fā)生的主要原因。但是,隨著社會的發(fā)展,女性吸煙人數(shù)的增加,女性膀胱癌發(fā)病率并沒有增加,相反在西方國家有降低的趨勢。另外,與聯(lián)苯胺類化學物質的頻繁接觸也是膀胱癌的誘因之一。司機、理發(fā)師、橡膠工人等與化學物質接觸的職業(yè)的人群膀胱癌的發(fā)病率會更高。膀胱癌的發(fā)生同時也與遺傳因素相關,有膀胱癌家族史的人患膀胱癌的概率比沒有膀胱癌的人概率要更高。一方面這可能與同一家族內(nèi)有相似的化學接觸經(jīng)歷相關,另一方面也可能是與身體對毒素排解相關的一些基因發(fā)生改變,導致膀胱癌的發(fā)生。另外有對于膀胱癌的遺傳性研究顯示,膀胱癌患者的二三級親屬的膀胱癌發(fā)病率(10%)遠高于一級親屬(3%)。大量的針對膀胱癌的癌癥基因組分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌基因H-ras、FGFR3、erbB2、 CCND1、mdm2,抑癌基因INK4A/ARF、Rb、TP53、PTEN、TSC1、PTCH、DBCCR1等, DNS錯配修復基因等基因的突變會與膀胱癌的發(fā)生相關。膀胱癌是一種在男性和女性中均會發(fā)生的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其男性發(fā)病率是女性的3～4倍。通常吸煙被認為是導致膀胱癌發(fā)病率性別差異的重要原因,有研究顯示至少一半的男性膀胱癌的發(fā)生和三分之一的女性膀胱癌的發(fā)生是與吸煙有關。但是有研究顯示吸煙并不能完全解釋導致膀胱癌發(fā)病率的性別差異的原因。因此,有必要在基因水平上尋找膀胱癌發(fā)病率性別差異的原因。有實驗證明,位于X染色體(q11-12)的雄激素受體(AR)基因可能是導致膀胱癌發(fā)病率性別差異的原因之一。雄激素受體與配體結合生成的轉錄因子可以調節(jié)靶基因的表達。實驗發(fā)現(xiàn)雄激素受體對正常的膀胱癌上皮細胞的生長和維持有著重要的作用。因此,雄激素受體的突變會失去其與配體的結合能力,導致膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。高通量測序技術的高速發(fā)展,對癌癥的研究提供了更豐富的平臺和數(shù)據(jù)基礎,研究者可以從更多不同的角度,研究癌癥在特定時期特定組織的特異性的表達。這些都為人類探索疾病的復雜的發(fā)生發(fā)展過程提供了良好的分析基礎。目前對膀胱癌的研究還不能完全解釋膀胱癌的發(fā)病機制,以及導致膀胱癌發(fā)病率性別差異的原因,因此有必要對其進行進一步的探索。目的本研究的目的在于利用公共數(shù)據(jù)庫TCGA中提供的膀胱癌RNA-Seq數(shù)據(jù),篩選潛在的女性特異表達的膀胱癌相關基因。以探究是女性膀胱癌中是否存在與男性不同的與膀胱癌發(fā)生相關的基因。同時,通過建立女性膀胱癌潛在相關基因的共表達網(wǎng)絡,尋找篩選出女性特異性膀胱癌相關基因所在的共表達模塊,通過對共表達網(wǎng)絡模塊的分析,了解其與女性膀胱癌之間的關系。方法本研究在差異表達分析的過程中使用R平臺下的DESeq2和edgeR兩種軟件。這兩種軟件都是在R平臺中對RNA-Seq差異表達分析比較成熟的軟件,并且這二者都是基于基因表達符合負二項分布的假設。由于其對離散度的估計方法不同所以這兩種軟件在最后篩選差異表達基因結果會有一定的不同。為了使篩選到差異表達基因的結果更可信,我們選取二者分析結果的交集作為最終得到的差異表達基因。為了篩選出女性特異的膀胱癌相關基因,我們對從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的238例膀胱癌相關樣本(包括169例男性腫瘤,10例男性正常,52例女性腫瘤,7例女性正常)分別按照性別和癌癥、正常分組。首先,分別篩選男性樣本中膀胱癌與正常樣本之間的差異表達基因,女性樣本中膀胱癌和正常樣本之間的差異表達基因。其次,對于所有的膀胱癌癌癥組織樣本我們按照性別篩選男性和女性之間的差異表達基因。最后,將女性膀胱癌與正常組織篩選出的差異表達基因去除在男性樣本中篩選出的差異表達基因,并與按照癌癥樣本的性別篩選出的差異表達基因集取交集。最終得到女性特異性的膀胱癌相關基因。隨后使用DAVID對這些基因進行基因注釋了解其功能。為了進一步探索我們篩選出的差異表達基因與女性膀胱癌之間的關系,我們使用R語言下的WGCNA軟件包,對TCGA數(shù)據(jù)庫中下載得到的52例女性膀胱癌的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行共表達網(wǎng)絡的構建。尋找篩選出的差異表達基因所在的模塊,并對這些模塊進行GO功能分析和KEGG相關通路分析,使用Cytoscape對共表達網(wǎng)絡中感興趣的模塊繪制該模塊的共表達網(wǎng)絡圖。本研究中的差異表達分析以及構建共表達網(wǎng)絡使用的分析軟件DESeq2、 edgeR和WGCNA包,均是R語言平臺下提供的生物信息分析軟件。R語言是最常用的生物信息分析平臺之一。與其他平臺相比,R語言最大的優(yōu)勢是其是對使用者是完全免費開源的,并且具有強大的統(tǒng)計分析和圖形繪制能力。其包含了多元的軟件包,這些包都是由全世界數(shù)據(jù)分析領域的科研人員共同開發(fā)和維護的。結果對238例膀胱癌及其相關樣本按照性別、癌癥和正常分組,分別進行差異表達分析得到的結果如下：在所有男性樣本中,癌癥與正常樣本之間使用DESeq2篩選出8249個差異表達基因,使用edgeR方法篩選出9048個差異表達基因,兩種方法所得差異表達基因的交集有8076個基因。在所有女性樣本中,癌癥與正常樣本間通過DESeq2得到3558個差異表達基因,使用edgeR方法篩選出4823個差異表達基因,兩種方法所得到的差異表達基因的交集有3432個基因。在兩種不同性別的癌癥樣本間篩選差異表達基因,DESeq2和edgeR分別篩選得到516和3988個差異表達基因,兩種方法所得到差異表達基因的交集中有469個基因。最后我們將在兩個方法共同得到的只在女性膀胱癌正常和癌癥樣本之間表達有差異,且在兩種性別的腫瘤樣本間表達也有差異的16個基因作為潛在的女性特異的膀胱癌相關基因。這些基因中有10個是表達上調基因,6個是表達下調基因。其中,CD36與微管內(nèi)皮細胞凋亡的生物學過程相關,參與PPAR信號通路。NRG1是新近發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因,可與ERBB3/ERBB4結合促進細胞增殖和分化。COL4A3突變會導致基底膜腎病。TGFBI是轉化生長因子β誘導的分泌蛋白,該蛋白具有抗腫瘤的功能。KLKB1調節(jié)內(nèi)在的凝血酶原活性的生物學過程相關是肺癌等診斷的生物標志物。PAQR8可結合孕激素參與卵子生成。對52例女性膀胱癌樣本建立共表達網(wǎng)絡,得到39個模塊,其中11個模塊與這16個篩選得到的女性特異的膀胱癌相關基因相關。其中模塊grey60包含CD36和CHIN3這兩個女性特異性的膀胱癌基因,且這兩個基因同時也是這個模塊的核心基因。這意味著這兩個基因與模塊涉及的生物學功能有很大的相關性。CD36與微管內(nèi)皮細胞凋亡的生物學過程相關,參與PPAR信號通路。通過對這個模塊進行生物信息學分析我們同樣發(fā)現(xiàn)這個模塊與PPAR信號通路相關。這樣的結果同時也驗證了我們共表達網(wǎng)絡構建的可信性,以及通過共表達網(wǎng)絡模塊基因的分析推測篩選出的膀胱癌基因與膀胱癌之間的關系的可行性。模塊black包含COL4A3和KLKBl這兩個篩選出的差異表達基因,該模塊與VEGF信號通路以及非小細胞肺癌相關。對各模塊的分析結果也同樣與單個基因的功能注釋的結果吻合。模塊brown包含篩選出的差異表達基因SHOX2,該模塊與細胞循環(huán)、小細胞肺癌和非小細胞肺癌相關。模塊green包含了篩選出的差異表達基因PEX11A,該模塊與子宮內(nèi)膜癌和P53信號通路相關。模塊pink包含了差異表達基因LRRC4,該模塊同樣與P53信號通路,胰腺癌和小細胞肺癌相關。而包含差異表達基因TGFBI的模塊steel blue,與NF-kb信號通路相關。同時綜合這些模塊相關的生物學功能,我們發(fā)現(xiàn)這些通路相關的生物學過程之間也存在著相互調節(jié)的作用,這些作用的共同發(fā)生可能是最終導致膀胱癌發(fā)生的原因。討論本研究通過利用膀胱癌樣本進行差異表達分析和共表達網(wǎng)絡分析。根據(jù)膀胱癌正常和癌癥樣本,以及樣本的性別為篩選因素,篩選出了女性特異性的膀胱癌相關基因。利用女性膀胱癌樣本構建出了女性膀胱癌的共表達網(wǎng)絡。利用篩選出的基因與其所在共表達網(wǎng)絡模塊之間的關系,通過對模塊內(nèi)基因集的生物信息學分析,推測篩選出的差異表達基因的功能同時驗證其與膀胱癌的相關性。本文最后指出了本研究結果的意義以及不足以及下一步要進行的內(nèi)容。本研究作為一個探究癌癥在性別之間差異的范例,研究中使用的分析策略同樣適用于其它水平數(shù)據(jù)及相關癌癥的研究。若通過其它水平的數(shù)據(jù)得到本文相似的結論,那么分析的結果可能更有參考和指導意義。
【關鍵詞】：膀胱癌 RNA-Seq 差異表達基因 共表達網(wǎng)絡
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.14
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 概論17-30
• 1.1 膀胱癌概述17-22
• 1.2 膀胱癌相關研究現(xiàn)狀22-23
• 1.3 TCGA數(shù)據(jù)庫介紹23-28
• 1.4 本文研究工作28-30
• 第二章 癌癥樣本及分析方法介紹30-41
• 2.1 膀胱癌樣本來源30
• 2.2 RNASeq差異表達分析方法30-34
• 2.2.1 RNA-Seq與微陣列比較30-31
• 2.2.2 RNA-Seq存在的問題31
• 2.2.3 基于RNA-Seq數(shù)據(jù)篩選差異表達方法31-32
• 2.2.4 基于RNA-Seq數(shù)據(jù)檢測差異表達方法比較32-34
• 2.3 共表達網(wǎng)絡構建及分析方法34-39
• 2.3.1 無尺度分布35-36
• 2.3.2 定義基因共表達相關矩陣36
• 2.3.3 定義鄰接函數(shù)并確定鄰接函數(shù)的參數(shù)36
• 2.3.4 定義節(jié)點的相異度36-37
• 2.3.5 聚類分析確定基因模塊37-38
• 2.3.6 WGCNA相關概念38-39
• 2.4 其他分析方法介紹39-41
• 第三章 膀胱癌相關基因性別差異表達分析41-50
• 3.1 材料和方法41-43
• 3.1.1 材料41
• 3.1.2 RNASeq表達數(shù)據(jù)的預處理41-42
• 3.1.3 篩選差異表達基因42-43
• 3.2 結果43-48
• 3.2.1 女性特異性膀胱癌相關差異表達基因43-45
• 3.2.2 注釋及生物學特征45-48
• 3.3 討論48-50
• 第四章 女性膀胱癌基因的共表達網(wǎng)絡分析50-68
• 4.1 材料和方法51-52
• 4.1.1 材料51
• 4.1.2 數(shù)據(jù)的預處理51
• 4.1.3 數(shù)據(jù)分析方法51-52
• 4.2 結果52-65
• 4.2.1 去除離群樣本52-53
• 4.2.2 選擇構建網(wǎng)絡參數(shù)53-55
• 4.2.3 構建共表達網(wǎng)絡55-62
• 4.2.4 相關模塊的生物信息學分析62-65
• 4.3 討論65-68
• 第五章 總結68-71
• 參考文獻71-76
• 附錄76-94
• 攻讀碩士期間發(fā)表論著94-95
• 致謝95-96

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本文編號：1008566