【摘要】：目的:構(gòu)建FNDC5缺失模型,明確FNDC5缺失對骨-脂代謝的影響,探討補(bǔ)腎方劑右歸丸上調(diào)FNDC5改善骨-脂代謝的作用和機(jī)制。方法:1、采用Talen技術(shù)構(gòu)建FNDC5基因缺失模型,通過提取DNA、PCR擴(kuò)增、基因測序等方法,確定模型的構(gòu)建是否成功,并通過熒光定量PCR檢測肌肉中FNDC5的表達(dá);2、將構(gòu)建成功的小鼠模型進(jìn)行分組,分為野生組、FNDC5缺失組、右歸丸+FNDC5缺失組,每組8只,雌雄各半。右歸丸組按16.65g/kg每日灌胃,灌胃4周,野生組、FNDC5缺失組每日灌胃生理鹽水。4周后2%水合氯醛麻醉后取材;3、各組小鼠血清進(jìn)行Irisin的ELISA檢測;4、右歸丸對FNDC5缺失小鼠脂代謝的作用:對各組小鼠稱重,檢測血中甘油三酯(TG)含量,提取皮下脂肪 RNA,RT-qPCR 檢測 FNDC5、PGC-1a、UCP1 mRNA 的表達(dá),免疫熒光檢測脂肪UCP1蛋白的表達(dá);5、右歸丸對FNDC5缺失小鼠骨代謝的作用:血清堿性磷酸酶(ALP)活力分析;micro-CT檢測各組小鼠骨密度和骨微細(xì)結(jié)構(gòu),HE染色觀察各組小鼠形態(tài)學(xué)變化,提取股骨 RNA,Real-time PCR 檢測 FNDC5、Runx2 mRNA 的表達(dá)。結(jié)果:1、成功構(gòu)建FNDC5缺失模型,肌肉中FNDC5 mRNA表達(dá)量明顯降低(P0.01)。2、各組小鼠血清進(jìn)行Irisin的ELISA檢測結(jié)果:與野生組比較,FNDC5基因缺失小鼠的血中Irisin蛋白含量明顯降低(P0.01);與FNDC5缺失組比較,右歸丸組血中Irisin蛋白含量顯著升高(P0.01)。3、右歸丸對FNDC5缺失小鼠脂代謝的作用:(1)與野生組比較,FNDC5缺失組在各時(shí)間點(diǎn)的體重?zé)o明顯差異。右歸丸組從第4周開始干預(yù),與FNDC5缺失組比較,雌性小鼠中,右歸丸組從藥物干預(yù)開始體重明顯降低,在第5周,體重雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但有下降趨勢;第6、7、8周,體重較FNDC5缺失組顯著降低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);雄性小鼠中,右歸丸組從藥物干預(yù)開始體重較FNDC5缺失組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有降低的趨勢;(2)與野生組比較,雌、雄小鼠FNDC5缺失組血清中TG含量明顯升高(P0.01);與FNDC5缺失組比較,右歸丸組血清中TG含量顯著降低(P0.01);(3)與野生組比較,FNDC5缺失組雌、雄小鼠皮下脂肪中FNDC5 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P0.05),PGC-1a和UCP1 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P0.05和P0.01);與FNDC5缺失組比較,右歸丸組雌、雄小鼠FNDC5的表達(dá)顯著升高(P0.05)。在雌性小鼠中,右歸丸組UCP1的表達(dá)明顯高于FNDC5缺失組(P0.01);在雄性小鼠中,右歸丸組UCP1的表達(dá)同樣顯著高于FNDC5缺失組(P0.05)。而右歸丸組雌、雄小鼠PGC-1a的表達(dá)與FNDC5缺失組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;(4)在免疫熒光中,野生組UCP1表達(dá)熒光較弱,且脂肪細(xì)胞數(shù)量較少,脂滴較大;與野生組比較,FNDC5缺失組UCP1熒光表達(dá)明顯增強(qiáng),且脂肪細(xì)胞數(shù)明顯增多,脂滴較小;與FNDC5缺失組比較,右歸丸組UCP1表達(dá)增多,脂肪細(xì)胞密集,脂滴較小。4、右歸丸對FNDC5缺失小鼠骨代謝的作用:(1)與野生組比較,雌、雄小鼠FNDC5缺失組血中ALP活力明顯降低(P0.01);與FNDC5缺失組比較,右歸丸組血清中ALP活力明顯升高;(2)在雌性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組tBMD、TbBMD、Tb.Th 均明顯降低(P0.01),Tb.Sp 明顯升高(P0.01)。與 FNDC5 缺失組比較,右歸丸組tBMD、TbBMD、Tb.Th均明顯升高(P0.05、P0.01和P0.05),Tb.Sp明顯降低(P0.01);在雄性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組tBMD,Tb.Sp未見明顯差異,TbBMD、Tb.Th雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有下降的趨勢;與FNDC5缺失組比較,右歸丸組Tb.Sp無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;tBMD,TbBMD、Tb.Th雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有上升趨勢。(3)HE染色結(jié)果可知,野生組可見骨小梁結(jié)構(gòu)完整、致密,骨小梁周圍骨細(xì)胞分布均勻;在雌性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組可見骨小梁數(shù)量明顯減少、稀疏,骨小梁斷裂,排列紊亂、不連續(xù),骨小梁間距明顯增寬,形成空洞;骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與FNDC5缺失組比較,雌性小鼠右歸丸組骨小梁排列明顯整齊,結(jié)構(gòu)完整,骨細(xì)胞明顯增多,但與野生組比較仍可見骨小梁裂痕。在雄性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組偶見骨小梁斷裂,排列較稀疏,骨小梁周圍骨細(xì)胞減少;與FNDC5缺失組比較,右歸丸組骨小梁排列緊密,結(jié)構(gòu)完整,骨細(xì)胞數(shù)量增加。(4)在雌性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組FNDC5與Runx2 mRNA的表達(dá)明顯降低(P0.01);與FNDC5缺失組比較,右歸丸組FNDC5與Runx2 mRNA的表達(dá)明顯升高(P0.05和P0.01)。在雄性小鼠中,與野生組比較,FNDC5缺失組FNDC5、Runx2 mRNA的表達(dá)雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有下降的趨勢;與FNDC5缺失組比較,右歸丸組FNDC5、Runx2 mRNA的表達(dá)雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但有上升的趨勢。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了 FNDC5基因缺失模型,并發(fā)現(xiàn)FNDC5缺失后,骨代謝與脂代謝均發(fā)生異常,而右歸丸能夠改善骨-脂代謝的異常,而FNDC5可能是右歸丸的作用靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2276575