【摘要】：目的： 通過組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞(1uman gingival fibroblast, HGFs),觀察HGFs體外培養(yǎng)的生物學特性,探討人類β-防御素3(Human Beta-Defensins3, hBD3)對HGFs增殖情況的影響,通過分析hBD3及與Pg-LPS聯(lián)合作用對HGFs分泌PGE2和MMP-1的情況,初步探討此過程中可能涉及到的TLR, MAPK, PI3K, NF-κB各級信號通路。研究hBD3在牙周炎致病機制方面的作用。 方法： 1.組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),免疫組織化學方法鑒定細胞來源,3-6代細胞用于實驗。 2.四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl terazolium, MTT)動態(tài)檢測人牙齦成纖維細胞在不同濃度hBD3干預下增殖情況。 3.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)檢測不同濃度hBD3不同時間點HGFs上清液中PGE2和MMP-1的含量,以及加入Pg-LPS以及不同信號抑制劑產(chǎn)生PGE2和MMP-1的量。 4.特定濃度hBD3,分別與等體積NF-κB信號抑制劑SN-50,50UM; PI3K信號抑制劑LY294002,20UM; JNK信號抑制劑SP600125,20UM; P38信號抑制劑SB203580,20UM; ERK信號抑制劑PD98059,10UM,分析hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及的信號通路。 結果： 1.采用組織塊培養(yǎng)法能夠在體外成功培養(yǎng)出HGFs。倒置相差顯微鏡下觀察細胞胞核均染,呈長梭形,并圍繞組織塊呈放射狀排列。抗角蛋白染色陰性,抗波形絲蛋白染色陽性,可見細胞來源于中胚層,結合取材部位證實所培養(yǎng)細胞為HGFs。 2.MTT檢測結果顯示,10ug/ml的hBD3分別與對照組和0.3ug/ml組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；10ug/ml的hBD3對HGFs的增殖作用最顯著。第3天細胞進入對數(shù)生長期,第5-6天細胞生長減緩,第7天逐漸進入平臺期,細胞生長曲線大致呈S形。 3. ELISA法檢測顯示,1ug/ml hBD3與對照組及10ug/ml hBD3組相比刺激HGFs產(chǎn)生PGE2差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著時間延長,PGE2的分泌量高于其他組；而對于MMP-1, hBD3濃度為1ug/ml時,與對照組及0.3ug/ml hBD3濃度組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),且隨著時間延長,MMP-1的分泌量高于其他組。 4.hBD3組與Pg-LPS組,Pg-LPS+hBD3組比較,在刺激HGFs產(chǎn)生PGE2和MMP-1的過程中Pg-LPS作用最強,hBD3組最弱,且三組之間均有顯著性差異。 5.hBD3聯(lián)合多種信號通路(TLR, MAPK, PI3K, NF-κB)抑制劑,刺激HGFs產(chǎn)生PGE2和MMP-1的量均下降,且減少的量與信號抑制劑種類相關。hBD3刺激HGFs產(chǎn)生PGE2的過程可被SP600125,SC-3060特異性阻斷；產(chǎn)生MMP-1過程中可被SB203580, PD98059, SC-3060, anti-TLR2抗體特性性阻斷。 結論： 1.組織塊培養(yǎng)法可成功培育出HGFs;細胞生長代謝旺盛,分裂較快,滿足實驗要求,培養(yǎng)過程中無菌操作,避免污染,是確保細胞培養(yǎng)成功的關鍵。 2.一定濃度的hBD3能促進HGFs增殖及其分泌PGE2和MMP-1,實驗結果顯示1ug/ml為hBD3的最佳效應濃度,最佳顯效時間為12h。 3.hBD3, Pg-LPS, hBD3+Pg-LPS三者作用HGFs產(chǎn)生PGE2, MMP-1的結果說明：Pg-LPS刺激產(chǎn)生PGE2, MMP-1作用最強,可見Pg-LPS對牙周組織具有較高的毒性,在牙周病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；hBD3在致炎方面與Pg-LPS相比作用較弱；hBD3與Pg-LPS聯(lián)合作用時,hBD3抵消部分Pg-LPS產(chǎn)生PGE2, MMP-1的作用,使得Pg-LPS致炎作用減弱。 4.hBD3刺激HGFs產(chǎn)生PGE2是通過MAPK中的JNK通路和NF-κB通路；hBD3刺激HGFs產(chǎn)生MMP-1過程中涉及了TLR2和MAPK中的P38、ERK信號通路以及NF-κB通路。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R781.42

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 張維瓊;吳巧英;汪國華;;防御素在口腔疾病中的研究進展[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志;2009年04期

2 許麗華;武海春;董福生;楊冬茹;李彬;;LPS刺激對體外培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞環(huán)氧合酶表達的影響[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志;2010年05期

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本文編號：2696132