本文選題：小鼠　切入點(diǎn)：骨髓來源細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 牙髓病、根尖周病是口腔科的常見病,多發(fā)病,其主要治療方法是根管治療,即在摘除感染壞死的牙髓組織、去除根管內(nèi)感染物質(zhì)的基礎(chǔ)上,用根管充填材料封閉原來牙髓組織所占據(jù)的空間,阻止細(xì)菌的侵入,以達(dá)到消除炎癥的目的。由于牙髓組織完全破壞,牙齒失去營養(yǎng)支持,喪失了原來的感覺及代謝功能,牙體變色,影響美觀,牙體組織變脆易折,需要進(jìn)行冠修復(fù)。同時(shí),根管治療的技術(shù)敏感性較高,需要精密的儀器和較高的技術(shù),治療過程較為復(fù)雜。根管治療及后續(xù)的冠修復(fù)均為非生物修復(fù),不能形成健康美觀的自然牙、生物牙。 由于年輕恒牙自身解剖特點(diǎn),牙根發(fā)育不完全,根尖孔尚未形成,根尖呈開放狀態(tài)。當(dāng)年輕恒牙出現(xiàn)牙髓嚴(yán)重病變或根尖周感染時(shí),由于開放的根尖無法形成有效的封閉,不能進(jìn)行常規(guī)的根管治療。目前,對(duì)于年輕恒牙根尖周炎的常規(guī)治療方法有手術(shù)后倒充填治療和根尖誘導(dǎo)成形術(shù)后再進(jìn)行根管治療。根尖手術(shù)后倒充填治療無法促進(jìn)牙根的繼續(xù)發(fā)育,常導(dǎo)致牙根變短,冠根比加大,患牙遠(yuǎn)期保存效果差。另一種治療方法是進(jìn)行根尖誘導(dǎo)成形術(shù),使根尖部形成牙本質(zhì)橋,封閉根尖孔。 近年來,有臨床研究和一系列病例報(bào)道均表明,牙髓壞死的年輕恒牙經(jīng)過根管消毒、誘導(dǎo)血液進(jìn)入根管和冠部的嚴(yán)密封閉,能夠獲得牙根的繼續(xù)發(fā)育和新生組織長入根管,X線表現(xiàn)為牙根變長、根管壁增厚、根尖孔閉合和根尖病變消失,同時(shí)牙齒重新獲得牙髓活力,這一治療方法稱為“牙髓再血管化”(Pulp Revascularization)。然而,在取得良好臨床療效的同時(shí),相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)卻證實(shí),根管內(nèi)的新生組織與正常牙髓完全不同,是由類牙骨質(zhì)、骨樣組織,牙周膜樣組織和疏松結(jié)締組織組成的。如何使新生的“再血管化”組織更加接近正常牙髓的組織結(jié)構(gòu)和功能,是目前“牙髓再血管化”研究中面臨的最關(guān)鍵問題。要解決這一問題,就需要對(duì)牙髓再血管化過程中干細(xì)胞成分的來源、不同來源干細(xì)胞之間競爭增殖的機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。 牙根繼續(xù)發(fā)育、新生組織的細(xì)胞來源和牙髓再血管化的確切機(jī)理仍然不清楚。多數(shù)學(xué)者推測其細(xì)胞有多種來源,包括殘存活髓組織的牙髓干細(xì)胞(DPSCs)、根尖牙乳頭干細(xì)胞(SCAPs)、牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)和骨髓干細(xì)胞(BMMSCs)。事實(shí)上,牙髓壞死和嚴(yán)重的根尖周感染(根尖病變的存在),以及根管消毒和沖洗藥物會(huì)顯著損傷牙髓干細(xì)胞和根尖牙乳頭干細(xì)胞,這兩組干細(xì)胞參與牙髓再血管化的可能性很小。因此,我們提出假設(shè)：骨髓來源細(xì)胞可能參與牙髓再血管化的過程,是新生組織的主要細(xì)胞來源。 研究目的和內(nèi)容 本實(shí)驗(yàn)擬通過建立小鼠磨牙去髓后牙髓再血管化模型,明確小鼠牙髓再血管化的發(fā)生過程及組織學(xué)特點(diǎn)。進(jìn)一步通過建立小鼠GFP+骨髓嵌合體模型,觀察骨髓來源細(xì)胞參與維持頜骨和牙齒組織及全身其他組織穩(wěn)定中的作用。并通過對(duì)GFP+骨髓嵌合體小鼠磨牙進(jìn)行牙髓再血管化處理,探討骨髓來源細(xì)胞在牙髓組織再血管化過程中的相關(guān)機(jī)制。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)如何調(diào)節(jié)骨髓來源細(xì)胞在牙髓組織再血管化過程中的增殖和分化奠定基礎(chǔ)。 材料與方法 (1)選取4周齡C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉,使用自行設(shè)計(jì)的小鼠專用固定和口腔牽拉裝置將小鼠固定置于口腔手術(shù)顯微鏡下,碘酒消毒手術(shù)野,并放置吸唾器,全部實(shí)驗(yàn)過程保持無菌操作。對(duì)實(shí)驗(yàn)牙進(jìn)行牙髓再血管化處理,使用高速不銹鋼球鉆(#1/4)從牙合面進(jìn)行開髓,然后用6#K銼去除牙髓,生理鹽水沖洗,6#和8#K銼繼續(xù)清理根管內(nèi)殘留的牙髓,并適當(dāng)擴(kuò)大根尖孔,生理鹽水沖洗根管,無菌紙尖吸干,8#K銼插入根尖,刺激根尖周組織出血至根管口水平,置一生理鹽水濕棉球,等待5分鐘讓血液形成血凝塊,MTA覆蓋,光固化流動(dòng)樹脂嚴(yán)密封閉開髓孔。分別于術(shù)后1周,4周,8周處死動(dòng)物,進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)觀察牙髓再血管化情況。 (2)通過將GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞移植到經(jīng)放射性照射處理的野生型C57BL/6小鼠體內(nèi),形成GFP+骨髓嵌合體小鼠,通過小動(dòng)物活體成像和組織學(xué)方法觀察骨髓來源細(xì)胞在牙髓、牙周組織、心臟、肺臟、脂肪、皮膚、腎臟等組織的分布。 (3)在建立好的GFP+骨髓嵌合體小鼠模型的基礎(chǔ)上,對(duì)嵌合體小鼠第一磨牙進(jìn)行牙髓再血管化處理,并通過小動(dòng)物活體成像、影像學(xué)、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)分析牙髓再血管化的情況,以及骨髓來源細(xì)胞在牙髓再血管化過程中的作用,并探討骨髓來源細(xì)胞參與牙髓再血管化過程的相關(guān)機(jī)制。 結(jié)果 (1)通過采用自行設(shè)計(jì)的小鼠口腔顯微手術(shù)固定及牽引裝置輔助下,充分暴露小鼠口腔術(shù)區(qū),小鼠上下頜磨牙區(qū)充分暴露,成功對(duì)小鼠上下頜第一磨牙進(jìn)行牙髓再血管化模型的建立,實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物生長情況良好,實(shí)驗(yàn)牙牙體無折裂或松動(dòng),充填物無脫落,牙周組織無異常�？谇火つo明顯紅腫。影像學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組第一磨牙髓腔見致密充填物影像覆蓋根管口,上方充填物完好,無脫落；根管腔可見,根尖1/3根管腔縮窄,有新生硬組織形成,根尖周組織和牙周組織未見明顯異常。對(duì)照組(根尖周炎)結(jié)果顯示第一磨牙髓腔開放,與外界相通,根管腔可見,近遠(yuǎn)中根尖1/3可見牙周膜間隙增寬,骨硬板消失,根尖周骨質(zhì)破壞。根分叉區(qū)亦出現(xiàn)較大范圍低密度影像,提示小鼠下頜第一磨牙可能存在副根管。組織學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組根管腔1/2均長滿了高度血管化的組織,近根尖部見大量鈣化組織,鈣化組織內(nèi)包繞少量高柱狀細(xì)胞,根管內(nèi)壁可見硬組織沉積,表面有胞體大、胞核深染、呈高柱狀的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞層,可見細(xì)胞呈假復(fù)層狀排列,類似成牙本質(zhì)細(xì)胞層。髓腔內(nèi)可見骨樣組織,不規(guī)則形的骨樣細(xì)胞位于陷窩內(nèi),骨樣組織的細(xì)胞數(shù)目較多。對(duì)照組根管腔空如,僅存少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞浸潤。影像學(xué)和組織學(xué)結(jié)果均提示成功建立小鼠去髓后牙髓再血管化動(dòng)物模型。 (2)GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞移植到經(jīng)放射性照射處理的野生型C57BLP6小鼠體內(nèi)后,小鼠在14天內(nèi)相繼出現(xiàn)了體重下降,食欲減弱、輕微腹瀉、脫毛、活力下降,毛發(fā)灰白伴脫毛等癥狀。小鼠移植后精神萎靡體重減輕在2周后逐漸恢復(fù),全部存活超過120天。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示移植小鼠外周血單核細(xì)胞綠色熒光比例都高于90%,嵌合成功率高,成功建立GFP+骨髓嵌合體模型。骨髓移植2月后,小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示移植后的小鼠四肢和頭部頜骨區(qū)域均可見較為明顯的綠色熒光,頜骨區(qū)域綠色熒光較其他區(qū)域更強(qiáng)；組織學(xué)結(jié)果顯示可在多種組織內(nèi)觀察到GFP+的骨髓來源細(xì)胞。包括肝臟、肺臟、心臟、腎臟、皮膚、脂肪、牙髓、牙周組織等。其中遷移到牙髓和牙周組織中的GFP+的骨髓來源細(xì)胞多于其他組織。 (3)對(duì)嵌合體小鼠第一磨牙進(jìn)行牙髓再血管化處理后,小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示,與未處理的小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組(牙髓再血管化)和對(duì)照組(根尖周炎)所在頜骨區(qū)域綠色熒光蛋白均有增加,其中實(shí)驗(yàn)組綠色熒光蛋白表達(dá)量增加明顯高于對(duì)照組,至術(shù)后第8周時(shí)兩組綠色熒光蛋白表達(dá)量無明顯差異,但與空白對(duì)照(未做任何處理)組相比仍處于較高的水平。進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示可見GFP+的骨髓來源細(xì)胞出現(xiàn)在再血管化的牙髓樣組織中,并分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞、血管組織、神經(jīng)組織等。提示在出現(xiàn)組織損傷的情況下,骨髓來源細(xì)胞可遷移至損傷處,參與新生組織的形成。 結(jié)論 (1)自行設(shè)計(jì)的小鼠口腔顯微手術(shù)固定及牽引裝置,可充分暴露小鼠口腔術(shù)區(qū),可對(duì)小鼠上下頜第一磨牙進(jìn)行牙髓再血管化模型的建立,具有操作簡便,節(jié)約手術(shù)時(shí)間,并能有效提高牙髓再血管化處理的成功率。影像學(xué)和組織學(xué)結(jié)果顯示成功建立小鼠去髓后牙髓再血管化動(dòng)物模型。 (2)通過將GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞移植到經(jīng)放射性照射處理的野生型C57BLP6小鼠體內(nèi)后,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示移植小鼠外周血單核細(xì)胞綠色熒光比例都高于90%,成功建立GFP+骨髓嵌合體模型。骨髓移植2月后,骨髓來源細(xì)胞可遷移至小鼠四肢和頭部頜骨區(qū)域,其中遷移到牙髓和牙周組織中的GFP+的骨髓來源細(xì)胞多于其他組織。 (3)對(duì)嵌合體小鼠第一磨牙進(jìn)行牙髓再血管化處理后,小動(dòng)物活體成像結(jié)果提示在出現(xiàn)組織損傷的情況下,骨髓來源細(xì)胞可遷移至損傷處,參與新生組織的形成。組織學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),再血管化的牙髓樣組織中有較多的骨髓來源細(xì)胞表達(dá),并可分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞、血管組織、神經(jīng)組織等。 綜上所述,本研究證實(shí),牙髓再血管化過程中進(jìn)入根管的細(xì)胞有多種組織來源,其中骨髓來源細(xì)胞通過遷移進(jìn)入根管腔并成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周膜、血管組織、神經(jīng)組織參與牙髓再血管化過程。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R781.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1567136