本文關(guān)鍵詞：曲古抑菌素A在人牙齦干細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 牙齦干細(xì)胞 組蛋白去乙酰化酶 曲古抑菌素A NF-κB信號通路 炎性細(xì)胞因子

【摘要】：目的:本研究擬采用組蛋白去乙�；敢种苿�,曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)改變?nèi)搜例l干細(xì)胞組蛋白乙酰化修飾狀態(tài),觀察牙齦干細(xì)胞炎癥性細(xì)胞因子的表達(dá)及分子調(diào)控機(jī)制,提供新型的藥物治療牙周炎及種植體周圍炎。方法:1.人牙齦干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定牙周炎疾病患者和無牙周疾病的健康人群的牙齦組織,通過酶對牙齦組織進(jìn)行消化,分離培養(yǎng)人牙齦干細(xì)胞。選取生長良好的第三代人細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測并分析人牙齦干細(xì)胞相關(guān)表面抗原OTC-4、SSEA-4、CD146和CD90的表達(dá),并對牙齦干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過堿性磷酸酶(ALP)染色、堿磷酶(ALP)活性檢測鑒定早期成骨分化,通過茜素紅染色以及鈣結(jié)節(jié)定量分析鑒定晚期成骨分化。通過成脂誘導(dǎo)后,進(jìn)行油紅O染色,檢測干細(xì)胞的成脂分化能力。2.HDAC抑制劑TSA對炎癥環(huán)境下牙齦干細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的抑制作用通過RT-PCR方法,檢測組蛋白去乙�；窰DACⅠ、Ⅲ、Ⅳ及炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α在健康及炎癥牙齦干細(xì)胞中的表達(dá)情況。不同濃度的TSA作用于人牙齦干細(xì)胞,通過MTT和Annexin V法檢測牙齦干細(xì)胞的增殖和凋亡的影響,確定TSA的最佳濃度;流式CBA法檢測TSA對炎癥微環(huán)境下牙齦干細(xì)胞胞外分泌炎性細(xì)胞因子的抑制作用;加入TSA刺激后,RT-PCR法檢測正常及炎癥牙齦干細(xì)胞中IL-6、IL-8的表達(dá)。3.HDAC抑制劑調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分子機(jī)制牙齦干細(xì)胞經(jīng)LPS及TSA刺激后的0,15,30,45,60分鐘提取總蛋白及核蛋白,通過NF-ΚB(p65)轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒對p65的活性進(jìn)行檢測,Western-blot法檢測I-κB、pI-κB、p65、p-p65蛋白的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1.使用Ⅰ型膠原酶和Dispase酶消化得到人健康和炎癥環(huán)境下的牙齦干細(xì)胞,顯微鏡下進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈體積短小,呈短梭形。流式細(xì)胞術(shù)檢測人牙齦干細(xì)胞的表面抗原OTC-4、SSEA-4、CD146、CD90呈陽性表達(dá)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)的作用下,7天后,ALP染色結(jié)果可見細(xì)胞藍(lán)染,誘導(dǎo)21天茜素紅染色,鏡橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。經(jīng)過成脂誘導(dǎo)28天后鏡下觀察可以見到折射點(diǎn),經(jīng)油紅O染色后,這些折射點(diǎn)呈橙紅色。2.RT-PCR凝膠電泳結(jié)果顯示,HDACⅠ,Ⅲ,Ⅳ和炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8在炎癥人牙齦干細(xì)胞中的表達(dá)較健康干細(xì)胞表達(dá)增加。增殖和凋亡檢測,確定TSA的最佳濃度為100 nM,加入100 nM TSA于LPS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組,RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),牙齦干細(xì)胞中IL-6、IL-8 mRNA在TSA刺激后表達(dá)顯著下降,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8在100 nM TSA刺激后顯著降低(P0.05)。3.NF-κB(p65)轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒檢測p65轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)現(xiàn)加入LPS后p65活性增高,加入TSA后p65活性降低,并在30分鐘時(shí)活性p65活性最高。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)LPS刺激后胞漿中磷酸化的I-κB和胞核中磷酸化的p65表達(dá)增加,加入100 nM TSA刺激后,胞漿中的I-κB和胞核中的p65磷酸化水平顯著降低。結(jié)論:1.健康及炎癥牙齦組織中存在干細(xì)胞,其表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4、CD146、CD90和SSEA-4,且具有多向分化潛能;2.組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA能夠抑制炎癥環(huán)境下牙齦干細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌;3.TSA抑制牙齦干細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌,可能與其抑制NF-κB信號通路有關(guān);
【關(guān)鍵詞】：牙齦干細(xì)胞 組蛋白去乙酰化酶 曲古抑菌素A NF-κB信號通路 炎性細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-13
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-13
• 一、人牙齦干細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定13-22
• 1.1 對象和方法13-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備13-14
• 1.1.2 牙齦組織收集14
• 1.1.3 人牙齦干細(xì)胞原代分離培養(yǎng)14-15
• 1.1.4 倒置顯微鏡觀察15
• 1.1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測牙齦干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物15
• 1.1.6 體外成骨誘導(dǎo)及檢測15-16
• 1.1.7 體外成脂誘導(dǎo)及染色16
• 1.2 結(jié)果16-20
• 1.2.1 顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)16-17
• 1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測GMSCs表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物17
• 1.2.3 GMSCs經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)分化堿性磷酸酶染色陽性17-18
• 1.2.4 GMSCs經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)分化堿性磷酸酶活性檢測陽性18
• 1.2.5 GMSCs體外成骨誘導(dǎo)分化具有礦化結(jié)節(jié)的能力18-19
• 1.2.6 GMSCs體外成脂誘導(dǎo)后油紅O染色呈陽性19-20
• 1.3 討論20-21
• 1.4 小結(jié)21-22
• 二、曲古抑菌素A對炎癥環(huán)境下牙齦干細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的抑制作用22-36
• 2.1 對象和方法22-27
• 2.1.1 主要的實(shí)驗(yàn)設(shè)備22
• 2.1.2 半定量RT-PCR檢測HDACⅠ、Ⅲ、Ⅳ及炎癥因子的表達(dá)22-24
• 2.1.3 MTT法檢測不同濃度TSA對GMSCs的增殖影響24
• 2.1.4 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V檢測不同濃度TSA對GMSCs凋亡影響24-25
• 2.1.5 半定量RT-PCR檢測TSA在炎癥微環(huán)境下對GMSCs炎性因子的作用25
• 2.1.6 流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測TSA在炎癥微環(huán)境下對GMSC炎性因子的作用25-27
• 2.2 結(jié)果27-33
• 2.2.1 HDACⅠ、Ⅲ、Ⅳ與炎癥因子IL-6、IL-8 在N-GMSC和I-GMSC中表達(dá)有差異27-28
• 2.2.2 MTT檢測 100 nM的TSA對GMSC增殖的影響28-29
• 2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V檢測 100 nM的TSA對GMSC凋亡的影響29
• 2.2.4 半定量RT-PCR檢測TSA抑制炎性微環(huán)境下GMSC中IL-6、IL-8mRNA的表達(dá)29-31
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)CBA法檢測TSA抑制炎癥微環(huán)境下GMSC中炎癥因子的表達(dá)31-33
• 2.3 討論33-34
• 2.4 小結(jié)34-36
• 三、曲古抑菌素A調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分子機(jī)制36-45
• 3.1 對象和方法36-41
• 3.1.0 主要的實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備36
• 3.1.1 NF-κB(p65) DNA結(jié)合活性檢測TSA對炎癥環(huán)境下GMSC中p65的轉(zhuǎn)錄活性的作用36-39
• 3.1.2 免疫熒光顯微鏡檢測TSA對炎癥環(huán)境下p65的轉(zhuǎn)錄活性39-41
• 3.2 結(jié)果41-43
• 3.2.1 TSA抑制炎癥環(huán)境下GMSC中p65入核的轉(zhuǎn)錄活性41-42
• 3.2.2 TSA抑制炎癥環(huán)境下GNSC中p65和I-κB磷酸化42-43
• 3.3 討論43-44
• 3.4 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明50-52
• 綜述 組蛋白去乙酰化酶及抑制劑對慢性炎癥性疾病中作用的研究進(jìn)展52-60
• 綜述參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60

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