發(fā)布時間：2020-08-25 07:49

【摘要】： 目的 慢性抽動障礙(chronic tic disorder)是一種復(fù)雜的、慢性神經(jīng)精神障礙，多起病于兒童期，以多種運動或發(fā)聲抽動為主要臨床表現(xiàn)。其患病率男性大于女性，常伴有強迫、多動等行為和情緒障礙。慢性抽動障礙的病因至今尚不十分明了，其病因?qū)W的研究近年來主要集中在分子生物學(xué)方面，目前比較公認的一個假說是抽動障礙的病因和多巴胺系統(tǒng)的紊亂有關(guān)系，涉及多巴胺能系統(tǒng)的代謝通路上的基因都成為了抽動障礙的候選基因，多巴胺受體基因也毫無爭議的成為人們研究的重點對象，其中最為引人注目的是多巴胺D4受體基因。 目前，對多巴胺D4受體基因多態(tài)性的研究主要集中在第三外顯子的48bpVNTR多態(tài)性與抽動障礙、ADHD等精神疾病相關(guān)性方面，但在中國遼寧地區(qū)，對于多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)的多態(tài)性分布特點及其與慢性抽動障礙的相關(guān)性研究均未見報道。為此，本課題選取多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性位點(-1240L／S、-521C／T、-616C／G)，首先在遼寧漢族人群中進行多態(tài)性分析，然后采用病例-對照研究多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)的多態(tài)性與慢性抽動障礙發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有不同多態(tài)性的pGL3-DRD4啟動子的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)，探討多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)的多態(tài)性與慢性抽動障礙相關(guān)的可能機制。 方法 1．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點的遺傳多態(tài)性分析 選擇100名無血緣關(guān)系個體，提取靜脈血白細胞基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)及等位基因特異性擴增技術(shù)，對DRD4基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點，進行基因型頻率和等位基因頻率分析，并進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗及連鎖不平衡分析。然后將中國遼寧人群DRD4基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點的等位基因頻率分布與文獻報道的其他人群進行比較，并進行X~2檢驗。 2．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點與慢性抽動障礙的關(guān)聯(lián)分析 選取無親緣關(guān)系的慢性抽動障礙患兒84例以及無親緣關(guān)系的健康個體100例為對照組，提取靜脈血白細胞基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)及等位基因特異性擴增技術(shù)檢測DRD4基因啟動子區(qū)-1240L／S，-616C／G和-521C／T 3個功能位點的基因型。用SHEsis在線統(tǒng)計軟件分析各位點等位基因、基因型、單倍型頻率及其組間差異。 3．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)-616C／G位點的功能分析 在上述實驗中選擇-616C／G位點分別為-616CC和-616GG的兩個純合子個體的基因組DNA為模板，構(gòu)建多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)-616C／G位點的熒光素酶報告基因的表達載體，分別為重組質(zhì)粒pGL3-D4C和pGL3-D4G。應(yīng)用脂質(zhì)體載體介導(dǎo)方法將重組質(zhì)粒pGL3-D4C和pGL3-D4G轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中表達，以雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)-616C／G位點的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果 1．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果 DRD4基因啟動子區(qū)-1240L／S的等位基因頻率分別為60％和40％；-616C／G的等位基因頻率分別為18％和82％；-521C／T的等位基因頻率分別為39％和61％。X~2檢驗顯示，基因型頻率的觀察值和期望值無顯著性差異，提示 該群體符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。3個位點間存在較弱的連鎖不平衡。中國遼寧地區(qū)人群與其他人群基因多態(tài)性分布頻率對照研究發(fā)現(xiàn)，-1240L／S位點在遼寧和上海地區(qū)等位基因分布無差異，但與日本、歐洲白種人、加拿大白種人比較有顯著性差異；-521C／T位點在遼寧和上海地區(qū)、日本、歐洲白種人、美國黑人等位基因分布比較均無顯著性差異；-616C／G位點在遼寧和上海地區(qū)、日本、歐洲白種人、匈牙利白種人等位基因分布比較均有顯著性差異。 2．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性-1240L／S、-616C／G、-521C／T位點與慢性抽動障礙的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 -1240L／S和-521C／T位點的等位基因和基因型頻率，在慢性抽動障礙組與正常對照組間比較，均無顯著性差異；-616C／G位點的等位基因頻率及其基因型頻率在慢性抽動障礙組顯著高于正常對照組(P=0.004，χ~2=8.419；P=0.020，χ~2=7.860)；DRD4基因-1240L／S，-616C／G和-521C／T組成的單倍型LCT的頻率在慢性抽動障礙組顯著高于正常對照組(p=0.012，χ~2=6.371)。 3．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)-616C／G位點的功能分析結(jié)果 成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-D4C和pGL3-D4G。將pGL3-D4C和pGL3-D4G重組質(zhì)粒分別與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測相對光強度，結(jié)果與pGL3-basic空載體相比，pGL3-D4C和pGL3-D4G重組質(zhì)粒的相對光強度均明顯增強，p＜0.05，表明-616C和-616G均具有啟動報告基因轉(zhuǎn)錄的能力。在HeLa細胞中，pGL3-D4C和pGL3-D4G重組質(zhì)粒的相對光強度與pGL3-basic空載體的相對光強度的比率分別為：7.6±0.5，34.7±1.5。pGL3-D4C比pGL3-D4G重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低(p＜0.05)，pGL3-D4G的轉(zhuǎn)錄活性約是pGL3-D4C的4.6倍。 結(jié)論 1．多巴胺D4受體基因啟動子區(qū)-1240L／S、-616C／G位點多態(tài)分布在世界范圍內(nèi)存在明顯的種族差異；而-521C／T位點的多態(tài)性分布可能無明顯的種族差異。 2．DRD4基因啟動子區(qū)多態(tài)性與慢性抽動障礙易感性相關(guān)，DRD4基因-616C等位基因可能是決定慢性抽動障礙個體易感性的重要因素，而含有LCT單倍型的個體發(fā)生慢性抽動障礙的相對風(fēng)險顯著增高。 3．DRD4基因啟動子區(qū)的-616 G＞C的變異可能在DRD4基因表達調(diào)控中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R749.94
【圖文】：

在新紋狀體的分布較低。目前共發(fā)現(xiàn)多巴胺D4受體基因有22種多態(tài)性，包括位于編碼區(qū)的7種多態(tài)性，還有位于非編碼區(qū)(即多巴胺D4受體基因上游啟動區(qū)與調(diào)節(jié)區(qū))的巧種多態(tài)性ll](見圖1一1)。以以勃印國例1里辦舊牲以州121今血今，中口目目忙泊以、1冉洲尹組甲l拍J腸G心右GC鈉j琦媽扮.3‘毋娜狠續(xù)秘蒸}略IN卜《)《》兒(【〔O們沉能陣滿甘門·《 6.78.9101今.af掬.“撼娜”翻品振:轟·，.甲公仁令口下門腳甘l內(nèi)口勻，刀飛A!粼刀口加傭肉27(X洲)隴Ul抑隴加悶‘洗以13，林)舀日臼眨.戈..r叮下r記r訓(xùn)N們孫些氣乎r二、~丫、~_1_一，圖1一1，多巴胺D4受體基因多態(tài)性圖示多巴胺D4受體基因編碼區(qū)的多態(tài)性可直接改變蛋白的氨基酸組成從而影響多巴胺D4受體功能，而位于非編碼區(qū)的多態(tài)性也不可忽視，如果在其結(jié)構(gòu)基因

一52lC/T位點瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果二.遼寧地區(qū)漢族人群ORO4基因啟動子區(qū)3個功能多態(tài)性基因型頻率分析3個功能多態(tài)性的基囚頻率‘J基因型頻率見表1一2所刁、。丫檢驗顯示，該多態(tài)位點從囚型頻率的觀察值和期望值無顯著性差異，提示該群體符合Hardy一Weinberg遺傳平衡法則，表明本研究資料可靠，具有群體代表性。

載體pGL3一Basi。位點圖譜(2)內(nèi)對照載體表達Renilla熒光素酶的pRL一TK載體購自美國Promega公司，結(jié)構(gòu)如圖3一2。pRL一TK載體含 HsvTK啟動子區(qū)域，可在多種細胞中高表達Renilla熒光素酶。在雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)中作為對照載體，為螢火蟲熒光素酶報告基因提供內(nèi)對照。 2223Bd鄺婦SV4O!atep漢以 1971Xb月(1閏0)Cs時5尸眨。。.1024圖3一2載體pRL一TK位點圖譜(3)陽性對照載體

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2803451