本文關(guān)鍵詞：膝溝藻毒素GTX2，3單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫快速檢測法的建立

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【摘要】：膝溝藻毒素2,3(gonyautoxin 23,GTX2,3)是一類氨基甲酸酯類麻痹性貝類毒素(PSP),具有分布廣、毒性強、對人體危害嚴重等特點,是我國南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的主要毒素之一,嚴重威脅廣東沿海海域貝類的食用安全。本研究主要采用乙二醛作為偶聯(lián)劑將小分子GTX2,3分別與載體蛋白BSA和KLH進行蛋白偶聯(lián),制備完全免疫抗原和檢測抗原,通過完全抗原的偶聯(lián)鑒定、動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞株克隆化培養(yǎng)技術(shù)及小鼠體內(nèi)誘生法制備抗GTX2,3單克隆抗體,并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化,建立了GTX2,3間接競爭ELISA酶聯(lián)免疫快速檢測法。實驗結(jié)果如下:(1)本實驗采用乙二醛作為偶聯(lián)劑將小分子GTX2,3分別與載體蛋白BSA和KLH進行蛋白偶聯(lián)制備完全免疫抗原和檢測抗原,并通過BCA蛋白濃度測定、紫外掃描、變性SDS-PAGE凝膠電泳和抗原免疫原性等鑒定方法,證明成功制備了具有較強免疫原性的GTX2,3完全抗原,其中免疫抗原的蛋白濃度為8.52mg/mL、分子偶聯(lián)比為15:1,檢測抗原的蛋白濃度為5.72 mg/mL,通過間接ELISA檢測免疫4次后的小鼠血清效價達到1:51200。(2)分別采取足墊及腹腔注射免疫、頸背部皮下多點免疫、腹腔注射免疫和快速免疫佐劑肌肉注射免疫共四種不同免疫方法免疫6-8周齡健康的雌性BALB/c小鼠,最高的小鼠抗血清效價分別為1:25600、1:51200、1:102400和1:51200。摘取不同免疫方案中抗血清效價最高的小鼠脾細胞與復(fù)蘇的SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。采用細胞融合技術(shù)及有限稀釋克隆技術(shù)成功篩選出3株能穩(wěn)定分泌抗GTX2,3的陽性雜交瘤細胞株2-2H11、3-2F2和3-3C9,雜交瘤細胞上清液效價分別為1:128、1:64和1:256,經(jīng)小鼠單抗亞類試劑盒鑒定,抗體亞類均為IgG1。并通過小鼠體內(nèi)誘生腹水法、辛酸-硫酸銨法(CA-AS)和Protein A株親和層析純化法、BCA蛋白濃度測定、間接ELISA法和單抗亞類鑒定,最終選擇抗GTX2,3單克隆抗體亞類為IgG1、抗體效價高達1:102400、抗體的親和常數(shù)為1.05×108 L/mol的具有良好的特異性的GTX2,3-3-3C9腹水單抗,用于后續(xù)的GTX2,3間接競爭ELISA方法的建立。(3)利用抗GTX2,3單克隆抗體3-3C9建立的檢測GTX2,3間接競爭ELISA方法的線性回歸方程為y=-14.821x+98.544,相關(guān)系數(shù)R2=0.9942,靈敏度(IC50)為1.653μg/mL,線性檢測范圍(IC20-IC80)為0.277-9.852μg/m L,檢測限為0.136μg/m L。用本實驗所建立的用GTX2,3-ic-ELISA計算的香港牡蠣的加標回收率為90.05%-113.7%,波紋巴非蛤的為94.55%-106.0%;用HPLC計算的香港牡蠣和波紋巴非蛤的加標回收率分別為97.98%-103.3%和96.90%-101.9%。兩者的加標回收率均在80%-120%范圍內(nèi),說明所建立的GTX2,3-ic-ELISA在一定濃度范圍內(nèi)具有與HPLC法一樣的準確度。
【關(guān)鍵詞】：膝溝藻毒素GTX2 3 完全抗原 單克隆抗體 間接競爭ELISA
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392;R446.6
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文縮寫詞表11-13
• 1 緒論13-21
• 1.1 研究背景13-19
• 1.1.1 PSP的來源13
• 1.1.2 PSP的生物鏈傳遞13-14
• 1.1.3 PSP的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分類及毒性14-15
• 1.1.4 PSP的理化性質(zhì)15
• 1.1.5 PSP的提取技術(shù)15-16
• 1.1.6 PSP的檢測方法16-19
• 1.2 研究目的與意義19
• 1.3 研究方法與技術(shù)路線19-21
• 1.3.1 研究方法19-20
• 1.3.2 技術(shù)路線20-21
• 2 GTX2,3 完全抗原的制備及鑒定21-33
• 2.1 實驗材料21-23
• 2.1.1 主要儀器和試劑21
• 2.1.2 實驗動物21
• 2.1.3 主要試劑的配制21-23
• 2.2 實驗方法23-26
• 2.2.1 GTX2,3 完全抗原的制備23-24
• 2.2.2 完全抗原偶聯(lián)效果的鑒定24-25
• 2.2.3 完全抗原免疫原性的鑒定25-26
• 2.3 結(jié)果與分析26-29
• 2.3.1 BCA法檢測完全抗原的蛋白濃度26
• 2.3.2 GTX2,3 完全抗原全波段紫外掃描鑒定26-27
• 2.3.3 免疫抗原GTX2,3-BSA變性SDS-PAGE凝膠電泳鑒定27-28
• 2.3.4 抗GTX2,3 小鼠免疫血清的效價測定28-29
• 2.3.5 檢測抗原GTX2,3-Gly-KLH最佳包被濃度的確定29
• 2.4 討論29-31
• 2.4.1 GTX2,3 與載體蛋白的偶聯(lián)29-30
• 2.4.2 完全抗原偶聯(lián)效果的分析30-31
• 2.5 小結(jié)31-33
• 3 GTX2,3 單克隆抗體的制備及鑒定33-56
• 3.1 實驗材料33-36
• 3.1.1 主要儀器和試劑33-34
• 3.1.2 主要試劑的配制34-36
• 3.2 實驗方法36-45
• 3.2.1 動物免疫36-37
• 3.2.2 小鼠免疫血清的收集和檢測37-38
• 3.2.3 抗GTX2,3 雜交瘤細胞株的建立38-42
• 3.2.4 小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備抗GTX2,3 腹水型單克隆抗體42-43
• 3.2.5 抗GTX2,3 腹水型單克隆抗體的純化43-44
• 3.2.6 抗GTX2,3 腹水型單克隆抗體的鑒定44-45
• 3.3 結(jié)果與分析45-51
• 3.3.1 4種免疫方案免疫小鼠抗血清的效價測定45-46
• 3.3.2 細胞融合及有限稀釋法克隆篩選46-48
• 3.3.3 GTX2,3 細胞上清液抗體效價的測定48
• 3.3.4 GTX2,3 陽性雜交瘤細胞株細胞上清液單抗亞類的鑒定48
• 3.3.5 GTX2,3 腹水單抗蛋白濃度及抗體效價測定48-49
• 3.3.6 GTX2,3 腹水單抗亞類鑒定49
• 3.3.7 GTX2,3 腹水單抗純化效果及IgG類蛋白輕、重鏈分子量的測定49-50
• 3.3.8 GTX2,3 腹水單抗抗體親和常數(shù)的測定50
• 3.3.9 GTX2,3 腹水單抗特異性的鑒定50-51
• 3.4 討論51-54
• 3.4.1 不同免疫方法的分析51-52
• 3.4.2 影響細胞融合的主要因素52-53
• 3.4.3 腹水單抗的純化53-54
• 3.5 小結(jié)54-56
• 4 GTX2,3 間接競爭ELISA檢測方法的建立56-71
• 4.1 實驗材料56
• 4.1.1 主要儀器和試劑56
• 4.1.2 單克隆抗體56
• 4.1.3 主要試劑的配制56
• 4.2 實驗方法56-59
• 4.2.1 GTX2,3-KLH與抗GTX2,3 單克隆抗體最佳工作濃度的確定56
• 4.2.2 檢測抗原GTX2,3-Gly-KLH最佳包被條件的選擇56-57
• 4.2.3 最佳封閉條件的確定57
• 4.2.4 最佳封閉時間的選擇57
• 4.2.5 抗GTX2,3 單克隆抗體的最佳反應(yīng)時間的確定57
• 4.2.6 GAM-HRP酶標二抗最佳稀釋濃度的選擇57
• 4.2.7 GAM-HRP酶標二抗的最佳反應(yīng)時間的確定57
• 4.2.8 TMB底物最佳反應(yīng)時間的選擇57-58
• 4.2.9 膝溝藻毒素GTX2,3 間接競爭ELISA競爭抑制標準曲線的繪制58
• 4.2.10 GTX2,3間接競爭ELISA 檢測限的確定58
• 4.2.11樣品前處理及模擬樣品的檢測58-59
• 4.3 結(jié)果與分析59-67
• 4.3.1 棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳工作濃度59
• 4.3.2 最佳包被條件的選擇59-60
• 4.3.3 最佳封閉條件的確定60
• 4.3.4 最佳封閉時間的選擇60-61
• 4.3.5 單抗最佳反應(yīng)時間的確定61-62
• 4.3.6 酶標二抗最佳稀釋濃度的選擇62-63
• 4.3.7 酶標二抗最佳反應(yīng)時間的確定63-64
• 4.3.8 底物最佳作用時間的選擇64-65
• 4.3.9 優(yōu)化后的GTX2,3 間接競爭ELISA檢測方法的反應(yīng)條件65
• 4.3.10 GTX2,3 間接競爭ELISA標準曲線的繪制及檢測限的確定65-66
• 4.3.11 GTX2,3 間接競爭ELISA準確度的測定66-67
• 4.4 討論67-69
• 4.4.1 GTX2,3- ic-ELISA檢測方法的建立67-68
• 4.4.2 最佳封閉條件的確定68
• 4.4.3 影響顯色反應(yīng)的因素68-69
• 4.5 小結(jié)69-71
• 5 結(jié)論與展望71-73
• 5.1 結(jié)論71-72
• 5.2 展望72-73
• 參考文獻73-77
• 致謝77-78
• 作者簡介78-79
• 導(dǎo)師簡介79-80
• 導(dǎo)師簡介80

【參考文獻】

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本文編號：676576