目的分析比較蠟樣芽胞桿菌HN001與plcR基因無義突變株HN1M的生物特征,并研究蠟樣桿菌中plcR基因的功能。方法繪制生長曲線比較蠟樣桿菌HN001和HN1M的生長性能;鑒別培養(yǎng)基平板比較兩菌株產(chǎn)胞外酶能力;結(jié)晶紫染色法測定兩菌株生物膜形成;RT-PCR分析兩菌株中溶血酶、磷脂酶和腸毒素基因的轉(zhuǎn)錄水平;以C57BL/6N小鼠為動物模型比較兩菌株的毒力大小。結(jié)果與HN001相比,HN1M穩(wěn)定期菌密度和生物膜形成能力顯著升高,溶血能力、產(chǎn)卵磷脂酶能力和對小鼠致病性顯著減弱;HN1M中毒力基因hlyD、clO、hly、cerA、cerB、plcA、cytK、nhe和hblCDB轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào);tlyA和hblA轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。結(jié)論與HN001相比,蠟樣桿菌plcR基因無義突變株HN1M溶血酶和磷脂酶的活性明顯降低,毒力明顯減弱,該研究為開發(fā)蠟樣桿菌工程菌和研究plcR的功能提供了新思路。
【部分圖文】：

蠟樣桿菌能產(chǎn)生卵磷脂酶、淀粉酶、蛋白酶等非特異性毒力因子。本研究采用MYP平板、淀粉平板、牛奶平板檢測HN1M產(chǎn)生胞外酶的能力。細(xì)菌利用甘露醇產(chǎn)酸MYP平板中的酚紅變黃，產(chǎn)卵磷脂酶分解平板中的卵黃會產(chǎn)生粉紅色沉淀環(huán)。淀粉平板上細(xì)菌生長24 h后加碘液，平板變藍(lán)，細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶利用淀粉產(chǎn)生透明環(huán)。牛奶平板呈乳白色，細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶利用脫脂奶粉產(chǎn)生透明環(huán)。將MYP平板、淀粉平板和牛奶平板分區(qū)，分別滴加T3時期D600值為0.05的HN001、HN1M和S05菌液，37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色及成環(huán)情況。1.2.3 結(jié)晶紫染色法測生物膜形成能力

生長曲線顯示，與HN001相比，plcR無義突變株HN1M穩(wěn)定期菌量高，經(jīng)重復(fù)性測量方差分析發(fā)現(xiàn)，兩種菌的生長狀況有顯著差異（F=19.705,P=0.011，圖2）。重復(fù)測量不同時間點(diǎn)有顯著差異（F=6700.70,P<0.0001），重復(fù)測量時間點(diǎn)與不同菌株間交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.895,P=0.002）。穩(wěn)定期細(xì)菌密度高時PapR開始表達(dá)并積累，CodY通過調(diào)節(jié)PapR的導(dǎo)入間接抑制PlcR-PapR，因此推測PlcR無義突變影響PapR表達(dá)，密度感應(yīng)遲緩，導(dǎo)致HN1M穩(wěn)定期菌量顯著升高。2.2 HN001、S05和HN1M產(chǎn)胞外酶和形成生物膜能力的比較

3組（S05、HN001、HN1M）總RNA提取效果良好，可用于RT-PCR檢測。與HN001中各基因相比，HN1M中除tlyA和hblA基因無差異外，其他基因的相對轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)（圖4）。推測plcR正調(diào)控基因hlyD、clO、hly、cerA、cerB、plcA、cytK、nhe和hblCDB，但可能不調(diào)控基因tlyA和hblA。PlcR box分析顯示，clO、plcA、cerAB和cytK的PlcR box位于100～300 bp區(qū)域，nhe操縱子基因的PlcR box位于nheA基因起始密碼子上游527～543 bp,hbl操縱子基因的PlcR box位于hblC基因起始密碼子上游879～895 bp,PlcR對其調(diào)控可能也受結(jié)合位置的影響[9]。圖4 HN001、HN1M毒力基因相對轉(zhuǎn)錄水平
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1 陳恬;SezAT系統(tǒng)及PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在2型豬鏈球菌中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

本文編號：2886644