本文關(guān)鍵詞：人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制

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【摘要】：研究背景及目的卵巢癌在婦科腫瘤中發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌居第三位,而其致死率卻占首位。卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤,其發(fā)生、發(fā)展較為隱匿,由于卵巢癌早期無癥狀,缺乏有效的篩查手段,臨床上80%的卵巢癌患者獲得診斷時已是中晚期,其5年存活率僅為20%～30%,而早期卵巢癌患者5年生存率為70%～90%。卵巢癌早期預(yù)后極好,但晚期只有10%～30%的存活率。因此,早期發(fā)現(xiàn)對卵巢癌患者非常重要。高靈敏度與高特異度的卵巢標(biāo)致物有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn),無疑也將提高卵巢癌的生存率,同時也有助于治療中的病情監(jiān)測、療效評價及預(yù)后判斷。人附睪分泌蛋白4(HE4)是一種新的、有潛力的卵巢癌標(biāo)志物,在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。HE4屬于乳清酸性4--硫化中心(WFDC)蛋白家族,全長11.78kb。HE4基因最早在人附睪上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)HE4基因與卵巢癌有關(guān)。這一新的血清標(biāo)記物在良性腫瘤患者及正常人血清中含量極低,但在卵巢癌患者血清中含量很高。而日益增多的研究證據(jù)表明,HE4在卵巢癌的早期診斷及疾病監(jiān)測方面具有良好的應(yīng)用前景。癌抗原125(CA125)自卵巢漿液囊腺癌中提取,是相對分子質(zhì)量為2×105～10×105的糖蛋白抗原。其在上皮性卵巢癌細(xì)胞中CA125高度表達(dá),并且能分泌到血液中。CA125是目前臨床應(yīng)用最廣的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物,主要用于卵巢癌的輔助診斷,同時也作為卵巢癌治療后療效觀察的指標(biāo)和監(jiān)測病情的手段,臨床實(shí)用價值較高。盡管大多數(shù)卵巢癌患者血清CA125水平升高,但在這些患者中也僅有不到50%的人在疾病的早期升高。雖然CA125具有較高敏感性,但很多婦科良性疾病患者血清CA125都會明顯升高,而且不能區(qū)分CA125在生理情況(月經(jīng)期、妊娠期)和一些良性疾病(子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫、伴有腹水的肝硬化等)的升高。研究證實(shí),HE4在卵巢癌組織的表達(dá)明顯高于卵巢正常組織,與以往所使用的標(biāo)志物相比,HE4在卵巢癌的診斷中具有很高的敏感性,尤其是在卵巢癌的I期診斷方面。而聯(lián)合檢測血清中HE4與CA125的水平得到的靈敏度比單獨(dú)使用兩者中的任何一個都高。標(biāo)記免疫學(xué),就是將標(biāo)記技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行分析測定的一門學(xué)科,是集實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科,其基本原理是利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和各標(biāo)記物的高靈敏可測量性來檢查體內(nèi)各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。隨著標(biāo)記技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,標(biāo)記免疫學(xué)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及食品安全檢測等多個領(lǐng)域。目前該方法包括一系列的免疫分析技術(shù)：熒光免疫分析(FIA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、膠體金免疫分析(GICA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)等。但這些傳統(tǒng)標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)在應(yīng)用中存在著一些不足。因此,開發(fā)新型標(biāo)記免疫技術(shù)非常有必要,一種新型定量免疫分析技術(shù)光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(Amplified luminescent proximity homogenous immunoassay, AlphaLISA)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)起源于1994年發(fā)明的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)(Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI),隨后美國PerkinElmer公司研制相關(guān)科研試劑(AlphaScreen(?))。作為近年興起的新型定量均相免疫學(xué)檢測技術(shù),它克服了傳統(tǒng)標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)需洗滌分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記的缺點(diǎn)。它結(jié)合單線態(tài)氧半衰期短、納米材料和激光技術(shù)等優(yōu)勢,實(shí)現(xiàn)了在均相中進(jìn)行反應(yīng)的操作過程。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有操作簡單、背景信號低、檢測重復(fù)性好、無放射性污染、不需分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記、高通量、易于自動化和高靈敏度等優(yōu)勢,代表了現(xiàn)在及未來分析檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。本研究采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)研制HE4和CA125檢測試劑并評價各項(xiàng)性能指標(biāo),同時與其它檢測試劑盒進(jìn)行比較,評價其在臨床檢測應(yīng)用中的可行性。方法：采用雙抗體夾心法研制人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑。1.受體微球與抗體連接將0.2 mg包被抗體加入到帶有濾膜的離心管中,以5510 g離心5～6 min,用標(biāo)記緩沖液(0.13 mol/L, pH 8.0 PBS)重復(fù)洗滌6次后,在抗體溶液中加入1 mg受體微球、10 pL 25 mg/mL NaBH3CN(用標(biāo)記緩沖液配制)、1.25 μL 10% Tween-20,用標(biāo)記緩沖液將體積補(bǔ)充到200 μL,37-C避光振蕩反應(yīng)48 h。加入10 μL 65 mg/mL CMO(用0.8 mol/L NaOH配制)封閉未結(jié)合位點(diǎn),37℃避光溫育1 h后離心洗滌,得到已連接抗體的受體微球,調(diào)整受體微球濃度為5 mg/mL。2.生物素與抗體連接將0.5 mg標(biāo)記抗體加入到帶有濾膜的離心管中,以5510g離心5～6 min。用標(biāo)記緩沖液(0.1 mol/L Na2CO3/NaHCO3, pH 9.5)重復(fù)洗滌6次后,在50μL抗體溶液中加入5 μL 20 mg/mL活化生物素[用二甲亞砜(DMSO)配制],室溫避光振動孵育4 h。利用PBS (pH7.4)4"C透析24 h,每6 h換液一次,收集透析袋中液體,并將其抗體濃度調(diào)整為0.5 mg/mL。3.參考標(biāo)準(zhǔn)品的配備用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、7.5% BSA、 0.9%NaCl、0.05% NaN3、0.01% Tween-20, pH7.8)將抗原配制成所需系列濃度,每瓶1ml分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?.試劑性能指標(biāo)的評價4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),信號值為縱坐標(biāo),由雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理。4.2 Hook效應(yīng)：對濃度遞增的多個參考標(biāo)準(zhǔn)品抗原進(jìn)行測定。4.3分析靈敏度：將零值參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測量20次,計算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測定值的均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得信號值減去本底信號值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算所得出的濃度,即為其靈敏度。4.4準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：使用陰性血清將HE4抗原稀釋作為參考樣品,并以自制標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測濃度與理論濃度的比值在0.90-1.10之間作為評價準(zhǔn)確性合格的標(biāo)準(zhǔn)。4.5精密度實(shí)驗(yàn)：采用低、中、高3個質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)進(jìn)行測定,得到各質(zhì)控品檢測值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV)。4.6特異性實(shí)驗(yàn)：將一定濃度的干擾物質(zhì)作為樣本檢測得到的相應(yīng)濃度即為特異性。4.7回收率實(shí)驗(yàn)：在已知濃度的血清樣本中添加不同濃度的純抗原,計算其理論值及實(shí)測值的比值,即回收率。4.8干擾實(shí)驗(yàn)：對加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽性標(biāo)本進(jìn)行測定,計算其回收率。4.9與國外試劑的比較實(shí)驗(yàn)：樣本用自制試劑與對照試劑檢測后將所測濃度值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：自制HE4試劑分析靈敏度為0.81 pmol/L,線性范圍內(nèi),HE4劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù),r2=0.996；稀釋回收率在93%-103%之間；分析內(nèi)和分析間的精密度分別為4.3%-7.2%和6.1%-7.7%,均低于10%；HE4試劑與CA15-3、AFP、CEA和CA125無交叉反應(yīng)。HE4試劑不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾； 134例臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒平行檢測,進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)性良好(,=0.978,P0.0001)。表明本研究研制的試劑有望取代的進(jìn)口檢測試劑盒用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。自制CA125試劑靈敏度為0.43 U/mL；精密度實(shí)驗(yàn)顯示自制試劑分析內(nèi)分析間變異系數(shù)均低于10%,顯示該系統(tǒng)的精密度較高。特異性結(jié)果顯示與CA15-3、AFP、CEA、HE4、CA19-9和CA50無明顯交叉反應(yīng),可見采用的兩株單克隆抗體特異性好。161份臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒平行檢測,結(jié)果顯示兩種方法測得的數(shù)值統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性良好(r2=0.992,P0.0001),表明本研究研制的試劑有望取代的進(jìn)口檢測試劑盒用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。結(jié)論：上述結(jié)果表明本研究研制的人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)(準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度、特異性等)均達(dá)到臨床檢測試劑要求,有望替代國外昂貴試劑應(yīng)用于臨床檢測和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究。正如文獻(xiàn)報道人附睪分泌蛋白4和癌抗原125在聯(lián)合使用時所展示出來的獨(dú)特優(yōu)勢,我們期待自制人附睪分泌蛋白4和癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑可以聯(lián)合應(yīng)用于卵巢癌的診斷與鑒別診斷、病情監(jiān)測及療效評價。
【關(guān)鍵詞】：光激化學(xué)發(fā)光免疫分析 人附睪分泌蛋白4 癌抗原125
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-28
• 第一章 人附睪分泌蛋白4光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制28-43
• 1.1 材料28-30
• 1.2 方法30-36
• 1.3 結(jié)果36-40
• 1.4 討論40-42
• 1.5 結(jié)論42-43
• 第二章 癌抗原125光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑的研制43-55
• 2.1 材料43
• 2.2 方法43-47
• 2.3 結(jié)果47-52
• 2.4 討論52-54
• 2.5 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 中英文縮略詞60-62
• 碩士期間論文發(fā)表情況62-63
• 致謝63-64

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本文編號：963080