本文關(guān)鍵詞：過(guò)表達(dá)人抗菌肽LL37腺病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染陰道上皮細(xì)胞

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【摘要】：背景:LL-37作為唯一存在人體的抗微生物肽,不僅能促內(nèi)皮細(xì)胞增殖,而且具有較強(qiáng)的促進(jìn)血管生成能力,在組織修復(fù)初期的血管生成中起重要作用。目的:構(gòu)建過(guò)表達(dá)人抗菌肽LL37基因的重組腺病毒,體外轉(zhuǎn)染犬陰道上皮細(xì)胞,檢測(cè)抗菌肽LL37的表達(dá)和分泌情況。方法:PCR法擴(kuò)增LL37基因片段,構(gòu)建融合綠色熒光蛋白(EGFP)和LL37的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,限制性?xún)?nèi)切酶酶切和測(cè)序法鑒定構(gòu)建的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,采用HEK293包裝后反復(fù)凍融擴(kuò)增、純化過(guò)表達(dá)LL37的腺病毒,終點(diǎn)稀釋法檢測(cè)腺病毒滴度。體外分離培養(yǎng)犬陰道上皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)LL37腺病毒,分別于轉(zhuǎn)染后1,2,3,5和7 d采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LL37的分泌表達(dá)情況。結(jié)果與結(jié)論:1限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定與DNA測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了GV314-LL37腺病毒表達(dá)載體,包裝純化后腺病毒滴度達(dá)到3×109 pfu/m L;2犬陰道上皮細(xì)胞可在體外成功分離培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代;3過(guò)表達(dá)LL37腺病毒可高效轉(zhuǎn)染陰道上皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下即可見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá),隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng),轉(zhuǎn)染72 h時(shí)表達(dá)最強(qiáng),轉(zhuǎn)染效率達(dá)89%;4ELISA證實(shí)陰道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)LL37腺病毒后表達(dá)分泌LL37,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中LL37表達(dá)量顯著高于空白組,表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性,轉(zhuǎn)染3 d表達(dá)最強(qiáng),轉(zhuǎn)染后7 d仍持續(xù)分泌表達(dá);5結(jié)果說(shuō)明,成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)人抗菌肽LL37基因的重組腺病毒,轉(zhuǎn)染犬陰道上皮細(xì)胞后高效表達(dá)分泌LL37,為構(gòu)建具有抗感染能力和促血管生成的功能性組織工程化陰道奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦3科;
【關(guān)鍵詞】： 陰道 上皮細(xì)胞 抗菌肽 組織工程 組織構(gòu)建 LL 陰道上皮細(xì)胞 腺病毒 轉(zhuǎn)染 國(guó)家自然科學(xué)基金
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81100395)~~
【分類(lèi)號(hào)】：R711
【正文快照】： 0引言Introduction 多種先天及后天因素均可導(dǎo)致陰道組織缺損,如先天性無(wú)陰道、兩性畸形、腫瘤術(shù)后造成的陰道缺損等[1]。目前臨床應(yīng)用的陰道成形術(shù)主要有采用皮片或皮瓣、乙狀結(jié)腸、腹膜組織替代修復(fù)陰道缺損。但這些方法會(huì)不同程度地導(dǎo)致陰道干澀、攣縮、異味、陰道瘢痕狹

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本文編號(hào)：922990