DHA對宮頸癌細胞株凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響

發(fā)布時間：2017-09-25 17:26

本文關鍵詞：DHA對宮頸癌細胞株凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響

【摘要】：[研究背景]隨著人口老齡化的逐漸加速,生存環(huán)境的質(zhì)量下降,全球的癌癥壓力越來越大。據(jù)GLOBOCAN統(tǒng)計,2008年約有1.27千萬新發(fā)癌癥患者,約有7.6百萬人口死于癌癥。宮頸癌是全球婦女中排名第二的惡性腫瘤,是最常見的女性生殖道腫瘤。自20世紀50年代以來,由于宮頸癌的細胞學篩查及病毒檢測指南的不斷更新,使得宮頸癌的發(fā)病率及病死率明顯下降。但在2011年公布的全球?qū)m頸癌新發(fā)病例仍約有52.9萬例,死亡病例約27.5萬,其中80%新發(fā)病例和85%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家。而我國高達28.8%,發(fā)病年齡以40～50歲為多,60～70歲又有一個發(fā)病高峰,該趨勢嚴重地威脅著女性身心健康,正逐漸成為全社會關注的焦點,是醫(yī)學界深入探討的重中之重,為宮頸癌患者尋找有效的治療模式顯得尤為重要。宮頸癌的主要治療手段是手術及放化療,近年來化療作為宮頸癌綜合治療的重要組成部分越來越受到國內(nèi)外學者的重視。為使腫瘤患者有較好的預后,降低復發(fā)率,減少放化療的副反應,提高患者生活質(zhì)量,人們不斷探討宮頸癌的治療模式,重點關注患者的自身內(nèi)環(huán)境,逐漸形成了腫瘤營養(yǎng)學的治療模式。許多流行病學調(diào)查及體內(nèi)外實驗研究顯示膳食補充co-3 PUFAs能夠預防和改善多種炎癥和腫瘤疾病。2009年美國腸外內(nèi)營養(yǎng)學會(ASPEN)發(fā)布的腫瘤病人及相關支持治療的新指南指出,鼓勵病人正常自然進食、口服輔助營養(yǎng)、人工EN或PN,依據(jù)不同的疾病狀態(tài),可以有效改善病人的營養(yǎng)狀況,提高免疫功能,糾正器官功能不全,營養(yǎng)支持已成為腫瘤綜合治療一個重要的組成部分,指南中關于腫瘤患者與攝入ω-3PUFAs的相關性研究發(fā)現(xiàn),并指出ω-3PUFAs可以維持腫瘤患者體重,增強免疫力等。許多流行病學研究還顯示ω-3PUFAs對于嬰兒發(fā)育、癌癥的預防及治療、心腦血管疾病有積極的作用；最近研究亦表明其在包括抑郁癥、癡呆等各種精神疾病中亦有積極作用。這些不飽和脂肪酸具有多重效應,包括抗炎、抗血小板聚集、降壓和降血脂,其效應可能通過多種不同的機制發(fā)生,包括影響細胞膜成分和功能,基因表達或產(chǎn)生類十二烯酸等。腫瘤營養(yǎng)學研究除了關注營養(yǎng)物質(zhì)對腫瘤患者體重、免疫力等方面的影響外,逐漸也開始關注營養(yǎng)物質(zhì)對腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及相關物質(zhì)對放化療敏感性的研究。研究初期,學者們主要通過在術前給予擇期手術的患者口服或靜脈給予ω-3PUFAs來探討其對術后感染率、住院時間等相關指標的影響。Lone S. Sorensen等發(fā)現(xiàn)術前給予不飽和脂肪酸對術后并沒有明顯的臨床積極作用,但是Wachtler等研究發(fā)現(xiàn)術前給予不飽和脂肪酸后可以減少術后并發(fā)癥。這些研究結果的不一致性可能與患者接受不飽和脂肪酸的攝入時間、攝入量及研究方法的不同有關,不飽和脂肪酸對預后是否有影響則需要更多的臨床研究,提供科學的臨床依據(jù)。近二十年來,人們更為關注的是針對ω-3PUFAs的DHA和EPA對于腫瘤的防治作用。通過不同體內(nèi)外的研究,發(fā)現(xiàn)ω-3不飽和脂肪酸(EPA和DHA)對于前列腺癌、乳腺癌、直腸癌、膀胱癌等腫瘤細胞有積極的生物學效應,并可以降低直腸癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥的患病率。針對腫瘤細胞增殖或凋亡研究中,Abdi, J等發(fā)現(xiàn)DHA和EPA可為促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡并能增強此類細胞對化療藥物的敏感性,同時卻不影響正常細胞的生物學功能,ALICJA ZAJDEL等人通過AA,EPA和DHA作用于體外培養(yǎng)的多種人黑色瘤細胞進行研究,他們發(fā)現(xiàn)這些脂肪酸的抗細胞增殖作用要根據(jù)脂肪酸的種類及細胞系的類型不同而不同。Belmiro Parada等通過誘導大鼠膀胱癌模型時發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸抑制癌前病變和惡變組織的發(fā)展,其中的機制可能是由于其抗炎、抗氧化、抗增殖和抗血管生成的特性所致的。研究發(fā)現(xiàn)PUFAs除了具有促進腫瘤細胞凋亡的作用外,還可以增強腫瘤細胞對化學藥物的敏感性,這一研究成果既可改善耐藥細胞對化療藥物的敏感性,還能減少化療藥物的劑量,降低化療藥物副反應的發(fā)生率。GaelleBenais-Pont等通過體外直腸腺癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)ω-3PUFAs可能作為一種營養(yǎng)佐劑增強人直腸腺癌的放療作用。Flavia De Carlo等通過對直腸癌干細胞樣細胞與EPA的研究發(fā)現(xiàn)EPA可以增強直腸癌320DM細胞系對標準化療藥物(5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑)的敏感性。Anita Vasudevan等人也研究發(fā)現(xiàn)EPA可以通過自身或氟尿嘧啶聯(lián)合作用而作為復發(fā)性直腸癌的有效的防治策略。雖然ω-3PUFAs在防治腫瘤中具有多重積極的生物學效應,但是它作用于腫瘤細胞的機制尚不明確,不同研究團隊通過在不同腫瘤或者在同一腫瘤的研究中所得出的作用機制也不盡相同。Elena Fasano等研究發(fā)現(xiàn)DHA通過降低GRP78蛋白(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的其中一個成分蛋白,可能是DHA的一個分子目標)的表達來發(fā)揮它在直腸癌細胞中的凋亡和抗腫瘤效應。Jeffrey D.Altenburg等在MDA-MB-231乳腺癌細胞株中研究發(fā)現(xiàn)EPA和DHA可以通過下調(diào)細胞表面受體CXCR4的表達而降低由CXCR4介導的癌細胞轉(zhuǎn)移。Arun Sharma等通過對卵巢上皮細胞癌中的SKOV-3和OVCAR-3細胞株的研究發(fā)現(xiàn)ω-3不飽和脂肪酸對卵巢癌細胞的抗增殖作用是多樣的。在某些條件下,它的抗增殖作用可能是由TGF-p通路介導的,這個由ω-3不飽和脂肪酸影響發(fā)揮效應的TGF通路也可能與P21蛋白的調(diào)控有關。Masayuki Fukui等通過體內(nèi)與體外對胰腺癌細胞研究發(fā)現(xiàn)EPA可以通過誘導胰癌細胞自噬而發(fā)揮它的抗腫瘤作用,但是具體的機制尚不清,可能與ROS水平和caspase蛋白表達相關。DHA (Docosahexaenoic acid.二十二碳六烯酸)作為ω-3PUFAs中最重要的一種營養(yǎng)成份,除可以抗炎、抗動脈粥樣硬化、促進胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育作用外,越來越多的證據(jù)表明其可以抑制多種腫瘤細胞的增殖,但其藥理作用復雜,抗腫瘤作用的機制尚不明確,國內(nèi)有研究表明DHA可能通過mTORC1/2信號通路抑制子宮內(nèi)膜癌生長,而ω-3不飽和脂肪酸對婦科腫瘤細胞的影響的研究尚鮮有報道。[研究目的]1.初步探討多不飽和脂肪酸DHA對宮頸癌細胞株凋亡的影響；2.初步探討多不飽和脂肪酸DHA對宮頸癌細胞株侵襲、轉(zhuǎn)移的影響。[研究內(nèi)容及方法]取對數(shù)生長期的Hela、Siha細胞,分為空白對照組、不同濃度DHA刺激組：1.DHA在體外對宮頸癌細胞株凋亡的影響：(1)采用MTT法檢測宮頸癌細胞在0μmol/L、20μumol/L、40μmol/L、 60μmol/L、80μmol/L、100μmol/LDHA的濃度下作用24h、48h、72h后,對宮頸癌細胞活力的抑制效應;(2)通過倒置顯微鏡,觀察在0μmol/L、IC25、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后的形態(tài)學改變；(3)采用Hoechst33258染色液染色法觀察0μmol/L、IC25、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后引起的凋亡形態(tài)學改變；(4)使用Annexin V/FITC雙染試劑盒,通過流式細胞學檢測(FCM)0μmol/L、IC25、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后引起的細胞凋亡率的變化情況；(5)采用蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測0μmol/、IC25、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后凋亡蛋白(Bax、Bcl-2、 Cleaved-Caspase 3)的表達情況；2.DHA在體外對宮頸癌細胞株侵襲、轉(zhuǎn)移的影響：(1)采用劃痕遷移試驗觀察不Opmol/L、IC25、IC50濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后,細胞體外水平遷移能力的改變；(2)采用transwell小室遷移和侵襲實驗觀察0μmol/L、IC25、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞后,細胞體外垂直轉(zhuǎn)移和侵襲能力的改變；(3)采用蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測Opmol/L、IC2、IC50、IC75濃度下的DHA作用于宮頸癌細胞48h后侵襲、轉(zhuǎn)移相關蛋白(VEGF、MMP-9)的表達情況。3.統(tǒng)計分析：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,多組間采用One-way ANOVA進行統(tǒng)計,兩兩比較使用LSD檢驗,P值小于0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。[研究結果]1、通過MTT法檢測細胞活力發(fā)現(xiàn),與對照組(0μmol/LDHA)比較,不同濃度DHA對宮頸癌細胞株HeLa細胞及Siha細胞的細胞活力均有明顯的抑制作用,且作用效果隨藥物濃度升高或作用時間延長而越明顯,呈時間-濃度依賴性(P0.05)。2、倒置顯微鏡下,與對照組(0 μmol/L DHA)相比,兩宮頸癌細胞株經(jīng)不同濃度DHA溶液刺激48小時后,細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。對照組中,Siha細胞呈長條梭形、單個細胞生長；而HeLa細胞則呈不規(guī)則梭形并呈癌巢狀聚團生長。在IC25組,細胞形態(tài)開始出現(xiàn)變化,細胞變圓,未見細胞明顯增殖,大部分細胞胞漿變得透亮。在IC50組,培養(yǎng)基上清中可見漂浮著透亮的死細胞,細胞間隙進一步增寬,細胞皺縮,細胞漿內(nèi)及細胞核周圍出現(xiàn)較多的透亮的顆粒,部分細胞己成細胞碎片。而在IC75組,視野下較少見到正常細胞,多為細胞碎片或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)如脂質(zhì)般的顆粒。光學顯微鏡下所見的細胞形態(tài)改變,表明DHA對宮頸癌細胞株具有較強的細胞毒性作用,且毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴性。3、Hoechst 33258染色后于熒光顯微鏡下觀察,對照組(0 μmol/L DHA)中,兩細胞株的細胞核形態(tài)呈圓形,染色均勻一致,邊緣清晰,可見HeLa細胞呈聚團樣生長,而Siha細胞則單個細胞生長。隨著DHA濃度的升高,細胞出現(xiàn)了凋亡經(jīng)典的核固縮、核碎裂、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡現(xiàn)象。結合光鏡下的細胞形態(tài)學改變及染色后細胞核的凋亡改變,進一步證實了DHA對宮頸癌細胞的毒性作用。4、使用Annexin V-FITC/PI雙染后經(jīng)FCM結果顯示,不同濃度DHA作用于細胞48h后,各處理組之間的細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義,隨藥物濃度增加,凋亡率提高,進一步驗證了DHA能通過促進宮頸癌細胞凋亡進而抑制宮頸癌細胞活力,其抗腫瘤效應是呈濃度依賴性。5、在細胞劃痕實驗中,細胞劃痕48h后,與實驗濃度組相比,劃痕處的面積修復明顯比空白對照組弱,尤其是在Siha細胞中,對照組面積已完全愈合,而藥物處理組的劃痕恢復速度明顯弱于對照組;而在transwell小室遷移實驗中,隨著DHA的作用濃度升高,穿過上室底膜而進入下室的細胞數(shù)目越少,亦提示DHA可以抑制HeLa細胞和Siha細胞的遷移能力。細胞劃痕實驗及transwell小室遷移實驗結果提示,不同濃度的DHA可以抑制宮頸癌細胞的遷移能力,且濃度越高,抑制能力越強。6、Transwell小室侵襲實驗中,DHA作用于HeLa細胞和Siha細胞48h后,細胞的侵襲能力下降,且隨著DHA作用濃度的提高,HeLa細胞和Siha細胞的侵襲能力呈濃度依賴性下降。7、Western Blotting提示,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯降低(P0.05),而促凋亡蛋白Bax表達量則明顯增加(P0.05), Bcl-2與Bax表達量的比值下降；cleaved caspase-3的表達量亦隨著濃度梯度的升高而增加(P0.05)；細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白血管內(nèi)皮因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達量隨著DHA作用濃度的升高而表達量降低(P0.05)。Bax、Bcl-2及cleaved-caspase 3的表達量情況與MTT、Hoechst 33258染色、流式細胞學結果相符；而VEGF、MMP-9的表達量結果與細胞劃痕實驗、transwell、室遷移侵襲實驗結果相符。[結論]DHA可通過調(diào)控cleaved-caspase 3、Bax及Bcl-2蛋白的表達情況從而促進宮頸癌細胞的凋亡；除此之外,亦能通過降低MMP-9、VEGF蛋白的表達而降低宮頸癌細胞的遷移能力,抑制宮頸癌細胞的侵襲。Bax、Bcl-2是細胞線粒體膜上的特異性蛋白,由此推測DHA有可能是通過線粒體途徑促進宮頸癌細胞的凋亡。
【關鍵詞】：宮頸癌 多不飽和脂肪酸 DHA 細胞凋亡 細胞遷移 細胞侵襲
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：