本文關(guān)鍵詞：T細(xì)胞來源Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周NK細(xì)胞功能誘導(dǎo)母胎免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的:不明原因反復(fù)妊娠丟失(URSA)嚴(yán)重威脅孕婦身心健康,而臨床預(yù)防治療URSA的方法尚不完善。目前國內(nèi)外研究多采用父方淋巴細(xì)胞過繼免疫誘導(dǎo)受孕母體對(duì)胚胎的有效免疫耐受治療URSA,但此種方法尚存在細(xì)胞制備的規(guī)范程度不高、各實(shí)驗(yàn)室療效不穩(wěn)定等不足,限制了在臨床上的推廣應(yīng)用。T細(xì)胞在生長增殖過程中可分泌釋放一種稱為Exosomes的膜性微囊結(jié)構(gòu),前期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究表明其在改善妊娠丟失孕鼠妊娠結(jié)局方面能夠產(chǎn)生比細(xì)胞治療更好的效果,并可以克服淋巴細(xì)胞免疫治療的局限性。本研究采用流產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,以分析T細(xì)胞來源Exosomes過繼轉(zhuǎn)輸對(duì)妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育、外周NK細(xì)胞的影響,旨在探討非細(xì)胞過繼免疫誘導(dǎo)母胎免疫耐受的機(jī)制,為反復(fù)妊娠丟失的免疫治療開辟新思路。方法:1雄性無關(guān)個(gè)體脾細(xì)胞及其Exosomes的制備:處死BALB/c雄鼠,無菌解剖取脾,獲得單個(gè)細(xì)胞懸液后經(jīng)刀豆蛋白A(Con A)刺激誘導(dǎo)72h,采用蔗糖密度梯度超速離心聯(lián)合超濾方法獲取exosomes。2妊娠丟失動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組:將雌雄小鼠隨機(jī)分組后按2:1合籠交配;CBA/J(♀)×BALB/c(♂)為正常妊娠對(duì)照動(dòng)物模型(Control組),CBA/J(♀)×DBA/2(♂)為URSA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。再將URSA孕鼠隨機(jī)分為妊娠丟失組(URSA組,孕第4天著床期尾靜脈注射生理鹽水)、細(xì)胞治療組(Cellular Therapy組,孕第4天尾靜脈注射無關(guān)個(gè)體BALB/c雄鼠脾細(xì)胞)、非細(xì)胞治療組(Non-cellular Therapy組,孕第4天尾靜脈注射無關(guān)個(gè)體BALB/c雄鼠脾T淋巴細(xì)胞來源exosomes)。3觀察胚胎發(fā)育情況:將各組CBA/J孕鼠于妊娠第14天分別處死,解剖胎盤組織,測(cè)量后計(jì)算胎盤組織體積,將各組吸收胚胎、存活胚胎分別計(jì)數(shù),計(jì)算胚胎吸收率及妊娠丟失率。4孕鼠外周NK細(xì)胞表型、表面受體及其效應(yīng)分子的表達(dá)分析:各組CBA/J孕鼠于妊娠第14天分別處死,無菌解剖取脾,制備脾單個(gè)核細(xì)胞懸液,用直接熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)NK細(xì)胞特征性分化抗原(CD3-CD56+、CDl6+CD56+、CDl6-CD56+)、抑制性及活化性受體(CD56+NKG2A+、CD56+NKG2D+)、活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(CD3-CD247+)以及殺傷效應(yīng)分子(CD56+Perforin+)的表達(dá)百分率。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:各組數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0版本軟件進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況;采用F檢驗(yàn)對(duì)孕鼠外周NK細(xì)胞特征性分化抗原、表面受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及效應(yīng)分子的表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),S-N-K法進(jìn)一步對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果:1對(duì)妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響Control組孕鼠的胚胎吸收率為5.78%,URSA組為21.17%,過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄鼠細(xì)胞治療組、T細(xì)胞來源exosomes的非細(xì)胞治療組分別為6.93%、3.25%。與未經(jīng)治療的URSA組相比,細(xì)胞及非細(xì)胞治療組胚胎吸收率均顯著下降(均P0.005),且均下降至Control組水平(均P0.05);非細(xì)胞治療組胚胎吸收率顯著低于細(xì)胞治療組(P0.05)。Control組孕鼠的妊娠丟失率為20%,URSA組為64%,細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組分別為24%、16%。與未經(jīng)治療的URSA組相比,細(xì)胞及非細(xì)胞治療組妊娠丟失率均顯著下降(均P0.005),且均下降至Control組水平(均P0.05);兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2對(duì)妊娠丟失孕鼠外周NK細(xì)胞免疫功能的影響2.1對(duì)NK細(xì)胞特征性分化抗原表達(dá)的影響Control組孕鼠CD3-CD56+NK細(xì)胞表達(dá)百分率為(61.92%±4.83%),URSA組細(xì)胞百分率為(57.26%±5.44%);在經(jīng)過細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后分別為(66.86%±6.76%,60.84%±6.88%);妊娠各組的組間比較均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與Control組孕鼠CD16-CD56+NK細(xì)胞百分率(56.33%±4.10%)相比,URSA組細(xì)胞百分率明顯下降為(43.98%±4.63%,P0.01);在經(jīng)過細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后顯著回升(分別為60.14%±4.98%,54.77%±6.74%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05)。兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與Control組孕鼠CD16+CD56+NK細(xì)胞百分率(6.39%±1.22%)相比,URSA組細(xì)胞百分率明顯升高為(13.28%±1.40%,P0.01);在經(jīng)過細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后降低(分別為4.73%±1.32%,6.07%±0.84%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05)。兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.2對(duì)NK細(xì)胞抑制性及活化性受體的影響與Control組孕鼠CD56+NKG2A+NK細(xì)胞表達(dá)率(1.42%±0.44%)相比,URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著下降為(0.35%±0.09%,P0.01);在經(jīng)過細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率回升(分別1.36%±0.30%、4.91%±0.99%,均P0.01);兩治療組組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Control組孕鼠CD56+NKG2D+NK細(xì)胞表達(dá)率為(1.29%±0.38%),URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率為(1.44%±0.22%);細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療組分別為(1.16%±0.41%、1.37%±0.26%);妊娠各組組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.3對(duì)NK細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的影響與Control組孕鼠CD3-CD247+NK細(xì)胞表達(dá)率(3.93%±1.32%)相比,URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率下降顯著(0.14%±0.06%,P0.01);在經(jīng)過細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率升高(1.36%±0.30%,P0.01)至Control組水平(均P0.05);在經(jīng)過非細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率(0.42%±0.18%)與URSA組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.4對(duì)NK細(xì)胞殺傷效應(yīng)分子表達(dá)的影響與Control組孕鼠CD56+Perforin+NK細(xì)胞表達(dá)率(7.99%±2.51%)相比,URSA組陽性細(xì)胞表達(dá)率升高顯著(11.44%±2.78%,P0.01);在經(jīng)過細(xì)胞治療以及非細(xì)胞治療后陽性細(xì)胞表達(dá)率降低(分別為7.51%±1.27%,8.12%±1.32%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05);兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。.結(jié)論:1過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個(gè)體外周淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞來源的非細(xì)胞成分Exosomes均可有效誘導(dǎo)母胎間免疫耐受,有利于正常妊娠。且Exosomes治療能夠發(fā)揮比外周淋巴細(xì)胞治療更強(qiáng)的改善妊娠結(jié)局的效應(yīng)。2過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個(gè)體外周淋巴細(xì)胞及T細(xì)胞來源Exosomes可引發(fā)孕鼠外周NK細(xì)胞特征性分化抗原、表面受體、活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及效應(yīng)分子的表達(dá)變化,從而有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受。3過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個(gè)體外周淋巴細(xì)胞與T細(xì)胞來源Exosomes相比,細(xì)胞及非細(xì)胞治療通過調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周NK細(xì)胞免疫功能誘導(dǎo)母胎免疫耐受的程度水平有所不同,細(xì)胞治療可使活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)升高,而非細(xì)胞治療對(duì)其無影響;兩者均可使抑制性受體顯著升高,但非細(xì)胞治療升高更顯著。
【關(guān)鍵詞】：妊娠丟失 過繼轉(zhuǎn)輸 T細(xì)胞來源Exosomes NK細(xì)胞 母胎免疫耐受 小鼠
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-29
• 附表29-31
• 討論31-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 綜述 蛻膜NK細(xì)胞調(diào)節(jié)正常妊娠的機(jī)制研究進(jìn)展41-57
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 致謝57-58
• 個(gè)人簡歷58

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：911679