本文關(guān)鍵詞：T細胞來源Exosomes調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周NK細胞功能誘導(dǎo)母胎免疫耐受的實驗研究

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【摘要】：目的:不明原因反復(fù)妊娠丟失(URSA)嚴重威脅孕婦身心健康,而臨床預(yù)防治療URSA的方法尚不完善。目前國內(nèi)外研究多采用父方淋巴細胞過繼免疫誘導(dǎo)受孕母體對胚胎的有效免疫耐受治療URSA,但此種方法尚存在細胞制備的規(guī)范程度不高、各實驗室療效不穩(wěn)定等不足,限制了在臨床上的推廣應(yīng)用。T細胞在生長增殖過程中可分泌釋放一種稱為Exosomes的膜性微囊結(jié)構(gòu),前期實驗動物研究表明其在改善妊娠丟失孕鼠妊娠結(jié)局方面能夠產(chǎn)生比細胞治療更好的效果,并可以克服淋巴細胞免疫治療的局限性。本研究采用流產(chǎn)實驗動物模型,以分析T細胞來源Exosomes過繼轉(zhuǎn)輸對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育、外周NK細胞的影響,旨在探討非細胞過繼免疫誘導(dǎo)母胎免疫耐受的機制,為反復(fù)妊娠丟失的免疫治療開辟新思路。方法:1雄性無關(guān)個體脾細胞及其Exosomes的制備:處死BALB/c雄鼠,無菌解剖取脾,獲得單個細胞懸液后經(jīng)刀豆蛋白A(Con A)刺激誘導(dǎo)72h,采用蔗糖密度梯度超速離心聯(lián)合超濾方法獲取exosomes。2妊娠丟失動物模型的建立及實驗分組:將雌雄小鼠隨機分組后按2:1合籠交配;CBA/J(♀)×BALB/c(♂)為正常妊娠對照動物模型(Control組),CBA/J(♀)×DBA/2(♂)為URSA實驗動物模型。再將URSA孕鼠隨機分為妊娠丟失組(URSA組,孕第4天著床期尾靜脈注射生理鹽水)、細胞治療組(Cellular Therapy組,孕第4天尾靜脈注射無關(guān)個體BALB/c雄鼠脾細胞)、非細胞治療組(Non-cellular Therapy組,孕第4天尾靜脈注射無關(guān)個體BALB/c雄鼠脾T淋巴細胞來源exosomes)。3觀察胚胎發(fā)育情況:將各組CBA/J孕鼠于妊娠第14天分別處死,解剖胎盤組織,測量后計算胎盤組織體積,將各組吸收胚胎、存活胚胎分別計數(shù),計算胚胎吸收率及妊娠丟失率。4孕鼠外周NK細胞表型、表面受體及其效應(yīng)分子的表達分析:各組CBA/J孕鼠于妊娠第14天分別處死,無菌解剖取脾,制備脾單個核細胞懸液,用直接熒光標(biāo)記流式細胞技術(shù)分別檢測NK細胞特征性分化抗原(CD3-CD56+、CDl6+CD56+、CDl6-CD56+)、抑制性及活化性受體(CD56+NKG2A+、CD56+NKG2D+)、活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(CD3-CD247+)以及殺傷效應(yīng)分子(CD56+Perforin+)的表達百分率。5統(tǒng)計學(xué)處理:各組數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0版本軟件進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。采用卡方檢驗比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況;采用F檢驗對孕鼠外周NK細胞特征性分化抗原、表面受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及效應(yīng)分子的表達進行單因素方差分析(ANOVA),S-N-K法進一步對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較。顯著性檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果:1對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響Control組孕鼠的胚胎吸收率為5.78%,URSA組為21.17%,過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄鼠細胞治療組、T細胞來源exosomes的非細胞治療組分別為6.93%、3.25%。與未經(jīng)治療的URSA組相比,細胞及非細胞治療組胚胎吸收率均顯著下降(均P0.005),且均下降至Control組水平(均P0.05);非細胞治療組胚胎吸收率顯著低于細胞治療組(P0.05)。Control組孕鼠的妊娠丟失率為20%,URSA組為64%,細胞治療組、非細胞治療組分別為24%、16%。與未經(jīng)治療的URSA組相比,細胞及非細胞治療組妊娠丟失率均顯著下降(均P0.005),且均下降至Control組水平(均P0.05);兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2對妊娠丟失孕鼠外周NK細胞免疫功能的影響2.1對NK細胞特征性分化抗原表達的影響Control組孕鼠CD3-CD56+NK細胞表達百分率為(61.92%±4.83%),URSA組細胞百分率為(57.26%±5.44%);在經(jīng)過細胞治療以及非細胞治療后分別為(66.86%±6.76%,60.84%±6.88%);妊娠各組的組間比較均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與Control組孕鼠CD16-CD56+NK細胞百分率(56.33%±4.10%)相比,URSA組細胞百分率明顯下降為(43.98%±4.63%,P0.01);在經(jīng)過細胞治療以及非細胞治療后顯著回升(分別為60.14%±4.98%,54.77%±6.74%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05)。兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與Control組孕鼠CD16+CD56+NK細胞百分率(6.39%±1.22%)相比,URSA組細胞百分率明顯升高為(13.28%±1.40%,P0.01);在經(jīng)過細胞治療以及非細胞治療后降低(分別為4.73%±1.32%,6.07%±0.84%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05)。兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.2對NK細胞抑制性及活化性受體的影響與Control組孕鼠CD56+NKG2A+NK細胞表達率(1.42%±0.44%)相比,URSA組陽性細胞表達率顯著下降為(0.35%±0.09%,P0.01);在經(jīng)過細胞治療以及非細胞治療后陽性細胞表達率回升(分別1.36%±0.30%、4.91%±0.99%,均P0.01);兩治療組組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Control組孕鼠CD56+NKG2D+NK細胞表達率為(1.29%±0.38%),URSA組陽性細胞表達率為(1.44%±0.22%);細胞治療以及非細胞治療組分別為(1.16%±0.41%、1.37%±0.26%);妊娠各組組間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.3對NK細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達的影響與Control組孕鼠CD3-CD247+NK細胞表達率(3.93%±1.32%)相比,URSA組陽性細胞表達率下降顯著(0.14%±0.06%,P0.01);在經(jīng)過細胞治療后陽性細胞表達率升高(1.36%±0.30%,P0.01)至Control組水平(均P0.05);在經(jīng)過非細胞治療后陽性細胞表達率(0.42%±0.18%)與URSA組無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.4對NK細胞殺傷效應(yīng)分子表達的影響與Control組孕鼠CD56+Perforin+NK細胞表達率(7.99%±2.51%)相比,URSA組陽性細胞表達率升高顯著(11.44%±2.78%,P0.01);在經(jīng)過細胞治療以及非細胞治療后陽性細胞表達率降低(分別為7.51%±1.27%,8.12%±1.32%,均P0.01)至Control組水平(均P0.05);兩治療組的組間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。.結(jié)論:1過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個體外周淋巴細胞或T細胞來源的非細胞成分Exosomes均可有效誘導(dǎo)母胎間免疫耐受,有利于正常妊娠。且Exosomes治療能夠發(fā)揮比外周淋巴細胞治療更強的改善妊娠結(jié)局的效應(yīng)。2過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個體外周淋巴細胞及T細胞來源Exosomes可引發(fā)孕鼠外周NK細胞特征性分化抗原、表面受體、活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及效應(yīng)分子的表達變化,從而有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受。3過繼轉(zhuǎn)輸無關(guān)雄性個體外周淋巴細胞與T細胞來源Exosomes相比,細胞及非細胞治療通過調(diào)節(jié)妊娠丟失孕鼠外周NK細胞免疫功能誘導(dǎo)母胎免疫耐受的程度水平有所不同,細胞治療可使活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達升高,而非細胞治療對其無影響;兩者均可使抑制性受體顯著升高,但非細胞治療升高更顯著。
【關(guān)鍵詞】：妊娠丟失 過繼轉(zhuǎn)輸 T細胞來源Exosomes NK細胞 母胎免疫耐受 小鼠
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-29
• 附表29-31
• 討論31-36
• 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 綜述 蛻膜NK細胞調(diào)節(jié)正常妊娠的機制研究進展41-57
• 參考文獻48-57
• 致謝57-58
• 個人簡歷58

【參考文獻】

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本文編號：911679