本文關鍵詞：玻璃化冷凍對小鼠卵母細胞透明帶的影響

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【摘要】：為了探索玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶物理特性及生化特性的影響,從中探尋玻璃化冷凍復蘇后卵母細胞受精率降低的影響因素,從而為改進玻璃化冷凍方法,提高玻璃化冷凍復蘇后卵母細胞受精率提供研究思路和理論依據(jù)。因此本研究選擇四組應用最廣泛的玻璃化冷凍保護液對小鼠卵母細胞發(fā)育進行觀察,選取對卵母細胞發(fā)育能力損傷最小的玻璃化冷凍方法,觀察玻璃化冷凍前后透明帶物理特性及生化特性的變化,采用熒光免疫組化觀察跨膜蛋白CD9在玻璃化冷凍后的損傷情況及恢復效果。結果發(fā)現(xiàn)：1、四組冷凍保護液對小鼠卵母細胞均有低毒性作用,各組復蘇存活率、受精率均顯著低于對照組(P0.05)。此外,3組卵裂率與對照組差異顯著(P0.05),4組囊胚率與對照組差異顯著(P0.05)。綜合各項指標,選取對卵母細胞發(fā)育能力損傷最小的1組,即配方為：HM+7.5%(DMSO+EG), HM+15%(DMSO+EG)+0.5mol · L-1 Su,作為冷凍保護液來進行下一步的實驗研究。2、在顯微鏡下,通過Hoffman系統(tǒng)觀察記錄冷凍組、暴露組和對照組中卵母細胞各觀測點透明帶厚度數(shù)值,并根據(jù)公式計算出各組卵母細胞透明帶厚度和厚度變量。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),冷凍組透明帶厚度(6.05μm)顯著高于對照組(5.771μm)(P0.05),其余各組間無顯著性差異；透明帶厚度變量各組間差異不顯著。結果表明,玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶厚度有影響,對卵母細胞透明帶厚度變量影響不大。3、在偏振光顯微鏡下,通過OCTAX Polar AIDE系統(tǒng)得到各組實時顯示的雙折射分值。經(jīng)統(tǒng)計分析得知,冷凍組雙折射分值(0.3)和對照組(1.22)相比差異顯著(P0.05)、與暴露組(2.02)之間差異顯著(P0.05),暴露組和對照組無顯著差異。結果表明,玻璃化冷凍顯著降低了卵母細胞透明帶雙折射分值。4、對透明帶厚度、厚度變量和雙折射分值間相關性進行分析,結果表明,透明帶厚度和雙折射分值間顯著相關。因此,在條件不足的情況下,可通過測量透明帶厚度體現(xiàn)雙折射分值所指示的結果。5、對相同數(shù)量冷凍組、暴露組和對照組卵母細胞透明帶提取物進行蛋白質(zhì)濃度(BCA法)及可溶性糖濃度(硫酸-苯酚法)測定。冷凍組蛋白濃度為0.218mg-mL-1與對照組(0.239 mg-mL-1)相比、與暴露組(0.223 mg-mL-1)相比差異都不顯著。冷凍組可溶性糖含量為0.041 mg-mL-1,顯著高于對照組(0.008 mg-mL-1)和暴露組(0.018mg-mL-1) (P0.05)。結果顯示,玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶中蛋白質(zhì)含量影響不大；玻璃化冷凍對透明帶中可溶性糖含量有顯著影響。6、通過熒光免疫組化,觀察冷凍組、暴露組和對照組卵母細胞跨膜蛋白CD9表達情況。結果發(fā)現(xiàn),冷凍組Ⅰ級細胞數(shù)明顯減少,并且出現(xiàn)Ⅳ級細胞。玻璃化冷凍會顯著減少卵母細胞表面CD9蛋白的表達(P0.05)。在加了IBMX培養(yǎng)基中延長培養(yǎng)(恢復組)中CD9表達情況,與冷凍組相比,培養(yǎng)對照組和恢復組中Ⅰ級細胞數(shù)均明顯增多,各組間均有顯著差異(P0.05)�？梢�,卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后,可通過延長培養(yǎng)使得CD9表達有所恢復,而經(jīng)過添加IBMX的培養(yǎng)基延長培養(yǎng)CD9表達恢復效果更為顯著。
【關鍵詞】：玻璃化冷凍 卵母細胞 透明帶 CD9 小鼠
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 縮寫表 Abbreviations12-13
• 第一章 透明帶及卵母細胞玻璃化冷凍研究概況13-22
• 1 透明帶的相關研究13-16
• 1.1 透明帶的結構13
• 1.2 透明帶的功能13-15
• 1.3 與胚胎發(fā)育潛力相關的透明帶特性15-16
• 2 卵母細胞的冷凍保存16-20
• 2.1 玻璃化冷凍的原理17
• 2.2 玻璃化冷凍保護劑17-18
• 2.3 玻璃化冷凍載體18-19
• 2.4 玻璃化冷凍對卵母細胞的影響19-20
• 3 四次跨膜蛋白CD920-21
• 3.1 四次跨膜蛋白家族20
• 3.2 CD9和精卵融合20-21
• 4 本研究的意義和目的21-22
• 第二章 不同玻璃化冷凍保護液對冷凍卵母細胞的影響22-29
• 1 材料與方法22-26
• 1.1 試驗材料22-24
• 1.2 試驗方法24-26
• 1.3 試驗設計26
• 1.4 數(shù)據(jù)分析26
• 2 結果26-27
• 3 討論27-29
• 第三章 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶厚度和雙折射分值的影響29-35
• 1 材料與方法29-31
• 1.1 試驗材料29
• 1.2 試驗方法29-30
• 1.3 試驗設計30-31
• 1.4 數(shù)據(jù)分析31
• 2 結果31-32
• 2.1 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶厚度和厚度變量的影響31
• 2.2 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶雙折射分值的影響31-32
• 2.3 卵母細胞透明帶厚度、厚度變量和雙折射分值之間的相關性32
• 3 討論32-35
• 第四章 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶蛋白和糖含量的影響35-44
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 試驗材料35
• 1.2 試驗方法35-37
• 1.3 試驗設計37-38
• 1.4 數(shù)據(jù)分析38
• 2 結果38-42
• 2.1 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶提取物蛋白濃度的影響38-40
• 2.2 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶提取物可溶性糖濃度的影響40-42
• 3 討論42-44
• 第五章 玻璃化冷凍對卵母細胞跨膜蛋白CD9的影響及恢復44-50
• 1 材料與方法44-47
• 1.1 試驗材料44-45
• 1.2 試驗方法45-46
• 1.3 試驗設計46
• 1.4 數(shù)據(jù)分析46-47
• 2 結果47-48
• 2.1 玻璃化冷凍對卵母細胞跨膜蛋白CD9的影響47
• 2.2 玻璃化冷凍卵母細胞跨膜蛋白CD9表達恢復47-48
• 3 討論48-50
• 第六章 結論50-51
• 參考文獻51-59
• 圖片與說明59-62
• 致謝62-63
• 作者簡介63
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況63

【參考文獻】

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本文編號：880169