本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-204介導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)病變隱匿不易早期發(fā)現(xiàn)且病情發(fā)展迅速,居女性生殖道惡性腫瘤死因的首位。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥是其主要生物學(xué)特征�？故С驳蛲鍪锹殉舶┺D(zhuǎn)移和化療耐藥的重要機(jī)制之一。卵巢癌中Trk B/BDNF通過(guò)激活下游的PI3K/AKT細(xì)胞存活通路發(fā)揮抗失巢凋亡作用。針對(duì)卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡的研究已有數(shù)年,最近micro RNAs在卵巢癌中的研究成為熱點(diǎn)。經(jīng)過(guò)篩選EOC組織中異常表達(dá)的micro RNAs,發(fā)現(xiàn)位于9號(hào)染色體上的mi R-204基因表達(dá)缺失,mi R-204在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中作為抑癌因子,可抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)BDNF為mi R-204的靶基因之一。目前尚且缺乏mi R-204在EOC失巢凋亡中作用的研究。本研究目的在于:①探究mi R-204在EOC抗失巢凋亡中的作用;②探求mi R-204在上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡中可能的作用機(jī)制。方法1選用SKOV-3、HO-8910細(xì)胞株,貼壁培養(yǎng)模擬卵巢癌原發(fā)灶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),稱(chēng)為貼壁培養(yǎng)組,建立失巢凋亡模型篩選出具有失巢凋亡抗性的細(xì)胞以模擬卵巢癌轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),稱(chēng)為失巢凋亡組;熒光定量PCR檢測(cè)SKOV-3、HO-8910細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)和懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)下mi R-204表達(dá)水平;2選擇第一部分實(shí)驗(yàn)篩選出的具有抗失巢凋亡表型的HO-8910細(xì)胞,轉(zhuǎn)染指示劑檢測(cè)HO-8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,構(gòu)建pre-mi R-204質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞。熒光定量PCR檢測(cè)mi R-204表達(dá);3建立失巢凋亡模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;4應(yīng)用體外侵襲模型,檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力;5應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力;6應(yīng)用熒光定量PCR法,檢測(cè)細(xì)胞BDNF m RNA表達(dá)水平;7 Western blotting檢測(cè)p AKT和總AKT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1失巢凋亡模型組中細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)、團(tuán)簇狀生長(zhǎng),模型構(gòu)建成功;失巢凋亡模型組較貼壁培養(yǎng)組mi R-204含量顯著降低,SKOV-3細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)組和失巢凋亡組中的數(shù)值分別為1±0.0082和0.7283±0.0082,HO-8910細(xì)胞在兩組中的數(shù)值分別為0.6242±0.0024和0.2577±0.0112,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2檢測(cè)HO-8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為90%,測(cè)序報(bào)告顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染后mi R-204質(zhì)粒組mi R-204含量為10.1±0.016,較其余3個(gè)對(duì)照組增高(P0.05);空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204 NC組中的mi R-204 m RNA含量依次為1±0.0039、1.07±0.014、0.929±0.011,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);3失巢凋亡模型中細(xì)胞呈團(tuán)簇狀懸浮生長(zhǎng);流式細(xì)胞分析術(shù)結(jié)果顯示mi R-204質(zhì)粒組凋亡率為73.22±0.70,較其余3個(gè)對(duì)照組凋亡率增加(P0.05);陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204NC組中細(xì)胞凋亡率依次為48.98±0.55、45.16±0.49、54.46±0.62,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4建立細(xì)胞體外侵襲模型,結(jié)果顯示mi R-204質(zhì)粒組中透膜細(xì)胞數(shù)為86±4.5789,較其余3個(gè)對(duì)照組減少(P0.05);陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204NC組中透膜細(xì)胞數(shù)依次為153±15.4973、150±14.1480、140±6.0800,(P0.05);mi R-204質(zhì)粒組卵巢癌細(xì)胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-204質(zhì)粒組中24h遷移距離為7.3±0.126,較其余3個(gè)對(duì)照組減少(P0.05);空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204 NC組細(xì)胞遷移距離依次為11.2±0.276、12.5±0.228、10.4±0.335差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。mi R-204質(zhì)粒組中48h遷移距離為10.5±0.252,較其余3個(gè)對(duì)照組減少(P0.05);3個(gè)對(duì)照組細(xì)胞遷移距離依次為20.3±0.289、19.2±0.288、20.6±0276差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);mi R-204質(zhì)粒組卵巢癌細(xì)胞遷移能力下降。6熒光定量PCR檢測(cè)BDNF m RNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示mi R-204質(zhì)粒組BDNF m RNA為0.22±0.0098,較其余3個(gè)對(duì)照組降低(P0.05);陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204NC組BDNF m RNA依次為1±0.0060、1.06±0.0139、0.96±0.0098,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);mi R-204質(zhì)粒組卵巢癌細(xì)胞BDNF m RNA水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7取p AKT/總AKT值表示AKT磷酸化水平。結(jié)果顯示mi R-204質(zhì)粒組中p AKT/總AKT值為0.068±0.028,較其余3個(gè)對(duì)照組降低(P0.05);空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染試劑組、mi R-204 NC組p AKT/總AKT值依次為0.159±0.046、0.175±0.037、0.164±0.051,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);mi R-204質(zhì)粒組卵巢癌細(xì)胞p AKT磷酸化水平降低。結(jié)論1 mi R-204介導(dǎo)了上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡;2 mi R-204可能通過(guò)Trk B/BDNF-PI3K/AKT通路介導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡。
【關(guān)鍵詞】：miR-204 上皮性卵巢癌 失巢凋亡 BDNF 磷酸化AKT
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 miR-204介導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡13-39
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器13-14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟15-23
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)15-16
• 1.2.2 失巢凋亡模型的建立16-17
• 1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞的miR-204表達(dá)水平17-18
• 1.2.4 pcDNA3.1(+)/ pre-miR-204質(zhì)粒的構(gòu)建18-20
• 1.2.5 檢測(cè)HO-8910卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率20-21
• 1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染21
• 1.2.7 轉(zhuǎn)染后構(gòu)建失巢凋亡模型21-22
• 1.2.8 FACS檢測(cè)4組細(xì)胞凋亡率22
• 1.2.9 體外侵襲模型檢測(cè)4組細(xì)胞的侵襲能力22
• 1.2.10劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4組細(xì)胞的遷移能力22-23
• 1.2.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 1.3 結(jié)果23-35
• 1.3.1 SKOV-3、HO-8910貼壁生長(zhǎng)和失巢凋亡狀態(tài)下細(xì)胞形態(tài)23
• 1.3.2 SKOV-3、HO-8910貼壁生長(zhǎng)和失巢凋亡狀態(tài)下miR-204表達(dá)水平存在差異性23-26
• 1.3.3 riboTRACERTM轉(zhuǎn)染指示劑檢測(cè)HO-8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率26
• 1.3.4 構(gòu)建pre-miR-204質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞后miR-204表達(dá)情況26-30
• 1.3.5 上調(diào)HO-8910細(xì)胞miR-204表達(dá)后失巢凋亡率(%)增加30-32
• 1.3.6 上調(diào)miR-204后HO-8910細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低32-35
• 1.4 討論35-37
• 1.5 小結(jié)37-39
• 第2章 上調(diào)miR-204表達(dá)對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞BDNF表達(dá)及AKT磷酸化的作用39-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器39
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑39-40
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟40-43
• 2.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)40
• 2.2.2 轉(zhuǎn)染后熒光定量PCR檢測(cè)BDNF mRNA水平表達(dá)情況40-42
• 2.2.3 Western Blot檢測(cè)4組細(xì)胞中AKT蛋白的磷酸化水平42
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42-43
• 2.3 結(jié)果43-47
• 2.3.1 上調(diào)miR-204對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)的作用43-45
• 2.3.2 上調(diào)miR-204對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞AKT磷酸化的作用45-47
• 2.4 討論47-48
• 2.5 小結(jié)48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 綜述 MicroRNAs介導(dǎo)上皮性卵巢癌細(xì)胞抗失巢凋亡的研究進(jìn)展55-62
• 3.1 抗失巢凋亡與卵巢癌55-57
• 3.1.1 外源性受體途徑55
• 3.1.2 內(nèi)源性途徑55-56
• 3.1.3 細(xì)胞間連接異常56
• 3.1.4 EMT56-57
• 3.2 miRNAs與抗失巢凋亡57-58
• 3.3 miRNAs與卵巢癌58-59
• 3.3.1 miRNAs與卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移58
• 3.3.2 miRNAs與卵巢癌耐藥58-59
• 3.4 結(jié)語(yǔ)和展望59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 結(jié)論62-63
• 致謝63-64
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介64-65
• 作者簡(jiǎn)介65-67
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：878133