本文關鍵詞：MicroRNA-204介導上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡的實驗研究

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【摘要】：目的上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)病變隱匿不易早期發(fā)現(xiàn)且病情發(fā)展迅速,居女性生殖道惡性腫瘤死因的首位。遠處轉移和化療耐藥是其主要生物學特征�？故С驳蛲鍪锹殉舶┺D移和化療耐藥的重要機制之一。卵巢癌中Trk B/BDNF通過激活下游的PI3K/AKT細胞存活通路發(fā)揮抗失巢凋亡作用。針對卵巢癌細胞抗失巢凋亡的研究已有數(shù)年,最近micro RNAs在卵巢癌中的研究成為熱點。經(jīng)過篩選EOC組織中異常表達的micro RNAs,發(fā)現(xiàn)位于9號染色體上的mi R-204基因表達缺失,mi R-204在胃癌、子宮內膜癌、卵巢癌中作為抑癌因子,可抑制其侵襲和轉移。生物信息學軟件預測BDNF為mi R-204的靶基因之一。目前尚且缺乏mi R-204在EOC失巢凋亡中作用的研究。本研究目的在于:①探究mi R-204在EOC抗失巢凋亡中的作用;②探求mi R-204在上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡中可能的作用機制。方法1選用SKOV-3、HO-8910細胞株,貼壁培養(yǎng)模擬卵巢癌原發(fā)灶細胞的生長狀態(tài),稱為貼壁培養(yǎng)組,建立失巢凋亡模型篩選出具有失巢凋亡抗性的細胞以模擬卵巢癌轉移灶細胞的生長狀態(tài),稱為失巢凋亡組;熒光定量PCR檢測SKOV-3、HO-8910細胞在貼壁生長和懸浮生長狀態(tài)下mi R-204表達水平;2選擇第一部分實驗篩選出的具有抗失巢凋亡表型的HO-8910細胞,轉染指示劑檢測HO-8910細胞轉染效率,構建pre-mi R-204質粒,轉染HO-8910細胞。熒光定量PCR檢測mi R-204表達;3建立失巢凋亡模型,流式細胞術檢測細胞凋亡率;4應用體外侵襲模型,檢測細胞的侵襲能力;5應用劃痕實驗檢測細胞遷移能力;6應用熒光定量PCR法,檢測細胞BDNF m RNA表達水平;7 Western blotting檢測p AKT和總AKT蛋白表達水平。結果1失巢凋亡模型組中細胞呈懸浮狀態(tài)、團簇狀生長,模型構建成功;失巢凋亡模型組較貼壁培養(yǎng)組mi R-204含量顯著降低,SKOV-3細胞在貼壁培養(yǎng)組和失巢凋亡組中的數(shù)值分別為1±0.0082和0.7283±0.0082,HO-8910細胞在兩組中的數(shù)值分別為0.6242±0.0024和0.2577±0.0112,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);2檢測HO-8910細胞轉染效率為90%,測序報告顯示重組質粒構建成功,轉染后mi R-204質粒組mi R-204含量為10.1±0.016,較其余3個對照組增高(P0.05);空白對照組、轉染試劑組、mi R-204 NC組中的mi R-204 m RNA含量依次為1±0.0039、1.07±0.014、0.929±0.011,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);3失巢凋亡模型中細胞呈團簇狀懸浮生長;流式細胞分析術結果顯示mi R-204質粒組凋亡率為73.22±0.70,較其余3個對照組凋亡率增加(P0.05);陰性對照組、轉染試劑組、mi R-204NC組中細胞凋亡率依次為48.98±0.55、45.16±0.49、54.46±0.62,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);4建立細胞體外侵襲模型,結果顯示mi R-204質粒組中透膜細胞數(shù)為86±4.5789,較其余3個對照組減少(P0.05);陰性對照組、轉染試劑組、mi R-204NC組中透膜細胞數(shù)依次為153±15.4973、150±14.1480、140±6.0800,(P0.05);mi R-204質粒組卵巢癌細胞侵襲能力降低,差異有統(tǒng)計學意義。5劃痕實驗結果顯示mi R-204質粒組中24h遷移距離為7.3±0.126,較其余3個對照組減少(P0.05);空白對照組、轉染試劑組、mi R-204 NC組細胞遷移距離依次為11.2±0.276、12.5±0.228、10.4±0.335差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。mi R-204質粒組中48h遷移距離為10.5±0.252,較其余3個對照組減少(P0.05);3個對照組細胞遷移距離依次為20.3±0.289、19.2±0.288、20.6±0276差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);mi R-204質粒組卵巢癌細胞遷移能力下降。6熒光定量PCR檢測BDNF m RNA表達水平,結果顯示mi R-204質粒組BDNF m RNA為0.22±0.0098,較其余3個對照組降低(P0.05);陰性對照組、轉染試劑組、mi R-204NC組BDNF m RNA依次為1±0.0060、1.06±0.0139、0.96±0.0098,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);mi R-204質粒組卵巢癌細胞BDNF m RNA水平降低,差異有統(tǒng)計學意義。7取p AKT/總AKT值表示AKT磷酸化水平。結果顯示mi R-204質粒組中p AKT/總AKT值為0.068±0.028,較其余3個對照組降低(P0.05);空白對照組、轉染試劑組、mi R-204 NC組p AKT/總AKT值依次為0.159±0.046、0.175±0.037、0.164±0.051,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05);mi R-204質粒組卵巢癌細胞p AKT磷酸化水平降低。結論1 mi R-204介導了上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡;2 mi R-204可能通過Trk B/BDNF-PI3K/AKT通路介導上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡。
【關鍵詞】：miR-204 上皮性卵巢癌 失巢凋亡 BDNF 磷酸化AKT
【學位授予單位】：華北理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 miR-204介導上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡13-39
• 1.1 實驗材料13-15
• 1.1.1 實驗儀器13-14
• 1.1.2 實驗試劑14-15
• 1.2 實驗方法及步驟15-23
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)15-16
• 1.2.2 失巢凋亡模型的建立16-17
• 1.2.3 熒光定量PCR檢測細胞的miR-204表達水平17-18
• 1.2.4 pcDNA3.1(+)/ pre-miR-204質粒的構建18-20
• 1.2.5 檢測HO-8910卵巢癌細胞轉染效率20-21
• 1.2.6 細胞轉染21
• 1.2.7 轉染后構建失巢凋亡模型21-22
• 1.2.8 FACS檢測4組細胞凋亡率22
• 1.2.9 體外侵襲模型檢測4組細胞的侵襲能力22
• 1.2.10劃痕實驗檢測4組細胞的遷移能力22-23
• 1.2.11統(tǒng)計學分析23
• 1.3 結果23-35
• 1.3.1 SKOV-3、HO-8910貼壁生長和失巢凋亡狀態(tài)下細胞形態(tài)23
• 1.3.2 SKOV-3、HO-8910貼壁生長和失巢凋亡狀態(tài)下miR-204表達水平存在差異性23-26
• 1.3.3 riboTRACERTM轉染指示劑檢測HO-8910細胞轉染效率26
• 1.3.4 構建pre-miR-204質粒及轉染HO-8910細胞后miR-204表達情況26-30
• 1.3.5 上調HO-8910細胞miR-204表達后失巢凋亡率(%)增加30-32
• 1.3.6 上調miR-204后HO-8910細胞侵襲和轉移能力降低32-35
• 1.4 討論35-37
• 1.5 小結37-39
• 第2章 上調miR-204表達對上皮性卵巢癌細胞BDNF表達及AKT磷酸化的作用39-48
• 2.1 實驗材料39-40
• 2.1.1 實驗儀器39
• 2.1.2 實驗試劑39-40
• 2.2 實驗方法及步驟40-43
• 2.2.1 生物信息學預測40
• 2.2.2 轉染后熒光定量PCR檢測BDNF mRNA水平表達情況40-42
• 2.2.3 Western Blot檢測4組細胞中AKT蛋白的磷酸化水平42
• 2.2.4 統(tǒng)計學分析42-43
• 2.3 結果43-47
• 2.3.1 上調miR-204對上皮性卵巢癌細胞BDNF mRNA表達的作用43-45
• 2.3.2 上調miR-204對上皮性卵巢癌細胞AKT磷酸化的作用45-47
• 2.4 討論47-48
• 2.5 小結48
• 參考文獻48-55
• 綜述 MicroRNAs介導上皮性卵巢癌細胞抗失巢凋亡的研究進展55-62
• 3.1 抗失巢凋亡與卵巢癌55-57
• 3.1.1 外源性受體途徑55
• 3.1.2 內源性途徑55-56
• 3.1.3 細胞間連接異常56
• 3.1.4 EMT56-57
• 3.2 miRNAs與抗失巢凋亡57-58
• 3.3 miRNAs與卵巢癌58-59
• 3.3.1 miRNAs與卵巢癌侵襲轉移58
• 3.3.2 miRNAs與卵巢癌耐藥58-59
• 3.4 結語和展望59
• 參考文獻59-62
• 結論62-63
• 致謝63-64
• 導師簡介64-65
• 作者簡介65-67
• 學位論文數(shù)據(jù)集67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 董玉瑋,侯進慧,朱必才,李培青,龐永紅;表觀遺傳學的相關概念和研究進展[J];生物學雜志;2005年01期

2 蘇立新;張陳平;胡永杰;曲行舟;劉瀏;李思毅;;BDNF對唾液腺腺樣囊性癌細胞株抗失巢凋亡能力和轉移的影響[J];中國口腔頜面外科雜志;2007年03期

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本文編號：878133